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(無題) 削除/引用 No.2304-6 - 2013/08/23 (金) 17:02:44 - しまなみ ありがとうございました。 どうやら、名無しさんのおっしゃる通りです。 おおさん、ありがとうございます。 恥ずかしながら、予算が無くて、ありものの抗体を矢継ぎ早に試しましたので…。ストレプトアビジンの他のキットもあることがわかりましたので、またやってみます。 日本語？へのご指摘2件、申し訳ありません。

(無題) 削除/引用 No.2304-5 - 2013/08/18 (日) 12:24:15 - 名無し ビオチン化１次抗体使うなら標識２次抗体はいらないよ。でもかわりになんかで標識したアビジンを反応させないと検出出来ないけど。westernの場合、アビジンービオチンーDABでもいいのだけれど、一般的にはHRP標識2次抗体を使って化学発光(ECL)で検出する方が今は主流と思う。ていうのが、感度的にもDABだと低いし、細胞内にはビオチン化修飾蛋白質もあるので、アビジンがこういうのと反応してfalse positiveみたく本当っぽいシグナル出す事もあり得るんでそれで、やっぱHRPで化学発光の方がいいんじゃないかなとか思う。 ビオチン化１次抗体と2次抗体で上手く出なかったのは１次抗体のビオチン標識部分が2次抗体による１次抗体の認識を邪魔したんじゃないか(つまりsteric inhibitionみたいなのが原因かも)。なわかんないけどそういうのもあり得るかなとかも思う。

(無題) 削除/引用 No.2304-4 - 2013/08/18 (日) 07:36:48 - がが I guess that you are not Japanese. Why don't you explain the detail in English?

(無題) 削除/引用 No.2304-3 - 2013/08/18 (日) 03:06:44 - おお >[Re:1] しまさんは書きました : > 試しに染めた、ビオチン化一次抗体のレーンです。 > 二次抗体を標識してますので、干渉したかな、とりかいしてます。 一次抗体の標識と二次抗体の標識の干渉ってあるのですか? 2次抗体がHRPなら、HRPとbiotinが干渉するということですよね。それはお調べになりましたか? 1次抗体がラベルされているので、2次抗体が結合しにくい可能性はあるとおもいます。なのでその実験系を組んだ時点で失敗です。まあできない可能性があるけどやってみるというんであれば、そこまではいいませんけど。 ビオチンでラベルしているのなら、どうしてストレプトアビジンを使うという発想にならないんでしょうか。そういう観点でお使いになろうとしているキットがどういうものか確認してみてください。

(無題) 削除/引用 No.2304-2 - 2013/08/17 (土) 23:02:05 - み あなたの日本語は理解できません・・・。 整理して下さい。

ビオチン化一次抗体が使い方わかりません ウェスタン 削除/引用 No.2304-1 - 2013/08/17 (土) 19:52:37 - しま 非常に非常に初歩的な質問ですみません。 いままで免疫組織染色 ＤＡＢ しかやってなくて、先週からウェスタンはじめました。教えてくれるかたがうまいので、に種類の検体をゲルに流し、面ぶれん転写後、切り分け、複数の一次抗体で次々染めて、綺麗なバンドがでています。 が、一つだけ、バックグラウンドすら出ない真っ白のがありました。 試しに染めた、ビオチン化一次抗体のレーンです。 二次抗体を標識してますので、干渉したかな、とりかいしてます。 手元には,免疫組織染色につかうＡＢCキットがあります。 また染めてみるなら、一次抗体のつぎ、ＡＢCキット.それから発色基質で良いですか？ ベクター社ＨPカタログを読むとそうかな、と。CSＴのはよくわかりません。

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