MG132は必ずしもproteoasome特異的阻害剤ではないですと習った。だからその蛋白質がpoly-Ub-proteasome系で分解されているということはどのくらい確かな？とおもった。それでより特異性の高いinhibitorでは調べている？のかなともちょっと思った。現時点のデータだけでは他のproteaseによる分解可能性も否定出来ない気がする。
仮にUb-proteasome系で分解されているとして、免疫沈降のサンプルはMG132処理した細胞ですか。なんもしてない普通の細胞をIPしてもub化蛋白質の代謝は迅速なのでub-protein conjugateはそんなにバシッとか見えないと思う（たぶん、オーバーイクスポーズしてようやくなんとかなんかそれっぽいのが上の方にうすく見えるんだけど、これどうよ、くらいのレベル）。それと細胞のイソペプチダーゼ活性だが、これもかなり半端でなくて、細胞は基本ub外す方向で動いてるから、lysis bufferにNEMとかIAA入れとかないとubすぐ外れる。病気系の細胞とかでproteasomeの活性が低下しているとか、MG１３２で長時間処理してub化蛋白質蓄積させたりとかならub-protein conjugatesはある程度ちゃんと見えるかもしれないけど。
タグがub化してるかどうかだけど、トリプシン消化してトリプティックペプチド群からub化peputideを抗ポリUb抗体-カラムで精製してMSにかければ、ubくっついたら枝分かれした変な風なペプチド断片ができるからMSのデータ上で分かると思う。ので今はそれは心配しなくていいと思う。 |
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