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(無題) 削除/引用 No.2289-10 - 2013/08/15 (木) 08:27:23 - 蛋白分解活性 ええと、酵母は一般に、蛋白分解活性が高いので、多くの人は酵母での発現を避けます。とくに、破砕するときは要注意（破砕のさい蛋白分解活性がさらに上がる？）。私なら、極力やりません。 なぜ、大腸菌ではだめなのか？を書けば、多少ヒントがもらえるかもしれませんが、秘密なら書く必要はありません。 シアノバクテリア、、、特殊ですね。

(無題) 削除/引用 No.2289-9 - 2013/08/14 (水) 19:50:20 - kamikazerr >qq 様 予想では分解されないとなっていますが、おっしゃるとおり分解の可能性も否定できません。 どうやらタンパクを酵母から取り出してin vitroにて反応させてみるのがやはり必要のようですね。

(無題) 削除/引用 No.2289-8 - 2013/08/14 (水) 18:20:45 - kamikazerr 皆様お答えありがとうございます。 ＞おお様 ご指摘されたように、現在酵母で発現させたタンパク質を精製して活性を評価しています。しかしながら、ポジコンとして取った大腸菌からの同じタンパク質でも活性が見られず（アッセイ系の問題？）現在の段階では結論が得られていません。条件を検討して活性を見ていこうとおもいます。 ＞cDNA様 大腸菌にて発現させる実験は自分で行いました（過去にも行われています）。 バンドの位置も酵母で発現させた場合と同じでした。翻訳後修飾の可能性は低そうですね。。 最終産物の検出はクロマトグラフィーにて行っておりますが、同時に基質を検出することはできません。 大腸菌で発現させた場合、最終産物の量がわずかにしか検出できなかったために酵母だと量が少なくて検出されていないだけなのかもしれません。 サンプルの濃度を増やして再度行ってみます。 ＞弘法様 酵母、大腸菌でそれぞれタンパクを発現させた場合のバンドの位置も同じだったのでこの可能性はほぼ消えますね。ご指摘ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.2289-7 - 2013/08/14 (水) 18:03:03 - qq 4）酵素タンパク質の反応産物（あなたの言う最終産物のこと）は、酵母内で激烈に分解されるので、検出できない可能性もありうる。

(無題) 削除/引用 No.2289-6 - 2013/08/14 (水) 17:45:47 - 弘法 「1、細菌にはないポストトランスレーショナルな修飾がついて機能をなくした」ことが絶対にあり得ないとは言いませんが、想定される理由のリストの中では最後の方だと思います。

(無題) 削除/引用 No.2289-5 - 2013/08/14 (水) 16:39:44 - cDNA 目的物の分解が速い可能性もあるんじゃないでしょうか。 ところで、どこまでが自分の実験なのでしょう？ 大腸菌での化合物の検出は自分でやっているのでしょうか？ 大腸菌でも酵母でも、何を使って目的物を検出して、その時にその基質も同時に検出出来る系でしょうか？出来るなら、発現によって酵母で基質の量に変化はないか、調べられるのか？ 元々、目的物が少し検出出来る程度だと発現系が違うと検出出来なくなっても、そんなこともあるだろう、とは思います。 修飾のことを気にされていますが、大腸菌発現の酵素と電気泳動では全く同じ位置に来ますか？ もし補欠分子族が必要な酵素だと、培地に添加してやらないといけない場合もあるかと思います。

(無題) 削除/引用 No.2289-4 - 2013/08/14 (水) 15:28:26 - おお そのきしつは酵母の細胞質にあるのですよね、、、 そのきしつが酵母の何らかのタンパク質などについていて、貴方の発現した蛋白がアクセスできないとか なにかこファクターが必要だけど酵母にはないとか。 バクテリアではそのきしつが、直接ではなくて蛋白か何かを介して供給されるとか 酵母でもその酵素が働いてきるが、それによってできたプロダクトは酵母内で不安定あるいは速やかに利用されて、見かけ上活性がない様にみえるとか 酵母ないではそのきしつににた物質が阻害剤としてはたらいているとか 単に発現かあなたの検出系で見るには十分ではないとか ちゃんとfoldingしてないとか シアノバクテリアは好熱性とかであれば最適温度に達していないとか きりがないです。 酵母で発現させて、一度そのタンパク質を粗精製でもしいからある程度きれいにしてまずは活性を測ってみるといいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.2289-3 - 2013/08/14 (水) 15:25:51 - kamikazerr ＞qq様 早速のお答えありがとうございます。 最終産物の一歩手前の産物、つまりは酵素が反応する基質は細胞質にも局在していますので細胞質にて反応を進められると仮定してます。 過去の文献を読むと細胞質以外にも、小胞体等にも存在しているようです。 この基質にオルガネラごとに濃度の偏りがあり、細胞質での濃度が予想しているほど高くない可能性はあると思います。 ご指摘ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.2289-2 - 2013/08/14 (水) 14:44:46 - qq 最終産物生成の反応は、酵母でも全て細胞質で進行する筈なのですか？ ＞2、細胞質に局在せず、予期せぬ位置に局在している の逆に、 3、酵母の代謝系を考えると別のオルガネラに局在しなければならないのに、原核のタンパクなので細胞質に局在してしまう。も、考えてよいかもしれません。

酵母においてのバクテリア由来タンパクの発現 削除/引用 No.2289-1 - 2013/08/14 (水) 12:15:33 - kamikazerr 現在シアノバクテリア由来のタンパク質を酵母に発現させて酵母にはもともと存在しない代謝物質をつくらせる研究をしています。 発現させるのはシアノバクテリアから取ってきた１つの遺伝子です。 この遺伝子を大腸菌で発現させると、ほしい最終産物は得られるのですが、酵母で発現させると最終産物がえられません。 組み換え後の酵母を用いてウエスタンで発現を確認しており、発現は確かにしているようです。 またタンパク質の基質となる物質も酵母内に存在しています。 最終産物が検出されない理由として、さまざまな原因が考えられると思うのですが、どのような原因が可能性として大なのでしょうか。 考え付くのは 1、細菌にはないポストトランスレーショナルな修飾がついて機能をなくした 2、細胞質に局在せず、予期せぬ位置に局在している です。 もし他の原因の可能性が高いのでは、と思われるものがありましたらご指摘いただければと思います。 また、対処法もあわせてお教えいただけると非常に助かります。 当方現在修士の学生で、ラボ内に自分だけ他の人とは違うプロジェクトを行っており適切な指導がいただけず困っております。 論文も探して見ましたが、なかなか参考になる論文が得られなかったためこの場にて質問させていただきました。 よろしくお願いします。

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