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(無題) 削除/引用 No.2287-3 - 2013/08/13 (火) 11:07:42 - AP あと、どういう戦略、手法で次世代SQするのか。 すくなくとも1st strandはニックを持たないはずなので、戦略によっては2nd strandはあまり気にしなくてもいいのかもしれない。

(無題) 削除/引用 No.2287-2 - 2013/08/13 (火) 10:36:05 - AP >1本鎖ｃDNAから2本鎖のｃDNAを合成するとき、RNase Hでニックを作りDNA Ligaseでそのニックを埋めていき、端はPolymerase1で修飾し、最後はT4ポリメラーゼで平滑化するのが一般的なようです。 ちょっと誤解があるようです。 RNaseHでニックを作り断片化されたRNAそれぞれをプライマーにしてPolIが2nd strand DNAを合成します。これはいわゆるNick translationという反応です。PolIは進行方向にぶつかる鎖を分解しながら伸長するので、strand replacementが起こります。いちばん5'末端側から伸長を始めたPolIがすべてのすべての鎖をreplaceするまで反応すればニックのない鎖ができるし、そうでなければニックが残ります。また過剰に反応させると5' exo活性でせっかくできたDNAが分解させる可能性もあります（dNTPが枯渇してくると伸長反応はせずに分解だけする）。 上で述べたようにPol Iがきれいにstrand replacementした状態ならニックはありませんのでligaseでニックを処理する必要はないでしょう。 ところで、よく分からないのですがライブラリーってどういう状態にするのでしょうか。 末端にアダプターをligationする？ベクターにligatonして大腸菌に入れる？ ならいずれにしてもligaseが必要なように思いますが。

cDNAライブラリの作成 削除/引用 No.2287-1 - 2013/08/13 (火) 10:07:21 - sac 次世代シーケンサーで非モデル動物のRNA-seqを行おうと思っています。 そこで、まずcDNAライブラリを作成するために、Total RNAから、mRNAを生成しRTでｃDNAの合成をしました。 この後2本鎖のcDNAを合成し、精製したあとシーケンサーに持っていくつもりなのですが、ここで疑問点があります。 1本鎖ｃDNAから2本鎖のｃDNAを合成するとき、RNase Hでニックを作りDNA Ligaseでそのニックを埋めていき、端はPolymerase1で修飾し、最後はT4ポリメラーゼで平滑化するのが一般的なようです。 しかし、プロトコルによってはLigaseをいれておらず、Polymerase1とRNace Hのみで合成を行っているものもあります。 今研究室にLigaseはなく、本当に必要なものか悩んでいます。 合成の機序から行けば必要だと思いますが、なくても合成が進むのならこのまま進めてもいいかなと思っています。 経験された方等ご教示ください。 よろしくお願いします。

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