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(無題) 削除/引用 No.2285-6 - 2013/08/13 (火) 10:16:58 - qq 「うまく動けばこの位はLucがでるはず。」というポジコンができると良いですね。 stableの場合は、導入されたゲノム上の部位に依存するでしょうから、導入するLuc自体に >>>Regulatory elements>minimal promoter>Luc となるところを、 >>>Regulatory elements>TetOperator>minimal promoter>Luc として、TetRVP16（TetONのやつ）を一過性に発現させると、TetOからLucを発現し、考えている転写因子を一過性に発現させるとRegulatory elementsを介してというふうにすることが可能な気がします。 毎度のことですが、誰かやっていそうに思います。

(無題) 削除/引用 No.2285-5 - 2013/08/13 (火) 09:05:29 - NE ご返答遅くなりました。 ＞＞Promoter-Lucを導入していない細胞で同じ実験を行いましたか？ ちょうどその実験をしたところ、細胞溶解液だけでとった値とほとんど変化ありませんでした。 ＞＞なんか最初から少し気になってたんだけど、補正用のコントロール(レニラとかLacZ)とかつかってないのかなぁ。 レニラを使用したところ、こちらの方は陰性対照の10倍くらいの値が出ており、補正出来なかったため、安定発現株を使用しています。 レニラに比べてPromoter-Lucの方が値の上昇が低いので、目的のプロモーターにあまり作用してない気もするのですが、レニラが上昇しているので、何かしら転写活性化に働いていることが言えないかと考えておりました。

(無題) 削除/引用 No.2285-4 - 2013/08/13 (火) 08:05:57 - おお なんか最初から少し気になってたんだけど、補正用のコントロール(レニラとかLacZ)とかつかってないのかなぁ。

(無題) 削除/引用 No.2285-3 - 2013/08/12 (月) 23:33:26 - qq Promoter-Lucを導入していない細胞で同じ実験を行いましたか？ 殆ど発現していないという可能性はないでしょうか？ 定量PCRできるのであれば、そこで確認しても良いかもしれません。 内在性のコントロール遺伝子を用意するのが良いのではないでしょうか？beta-actinでもL32でもなんでも結構（じゃないかもしれないけど）です。

(無題) 削除/引用 No.2285-2 - 2013/08/10 (土) 14:49:23 - おお バックグランドが200だから理論的には引いた方がいいですけど、、、、まあ引いたら4倍で見えはよくなりますが、、、ちょっとよわいですね。なのでこれだけではちょっと信用していいのかわかりませんけど、実験系や全体の実験のなかでの位置づけもわからないですから何ともいいようがありませんが、、、

レポーターアッセイでのブランク 削除/引用 No.2285-1 - 2013/08/10 (土) 14:07:50 - NE レポーターアッセイを最近始めました。 Luc遺伝子の上流にプロモーター領域を挿入したベクターを作製し、それをゲノムにランダムに組み込んだ細胞株を使用しております。 レポーターアッセイの結果、あるDNA結合タンパク質を発現させた場合の値が600、GFPを発現させた場合（陰性対照）の値が300、使用した細胞溶解液だけでとった値が200でした。 この場合、単純に600と300だけの比較で2倍と判断するものでしょうか？ あるいは、細胞溶解液でとった値をブランクとして引いて比較するものでしょうか？ 基本的な点で恐縮ですが、皆様の判断をお聞かせ願えますでしょうか。

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