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(無題) 削除/引用 No.2276-11 - 2013/08/25 (日) 09:48:55 - mon >[Re:10] なかあきさんは書きました : > H2O2, MeOHともNon-fusionはばっちり消えましたが、Fusion proteinは消えませんでした。 Fusion proteinが消光しないとなると、融合させた事によって、有機溶媒に晒されにくい（周りに水分子が少ない？？＝タンパク質に囲まれている？？？）環境に置かれているのでしょうか？ mStrawberryとの間のlinker配列を長くするとかで改善するかも....

(無題) 削除/引用 No.2276-10 - 2013/08/24 (土) 06:02:07 - なかあき H2O2, MeOHともNon-fusionはばっちり消えましたが、Fusion proteinは消えませんでした。あと、アセトンを試してみるつもりです。

(無題) 削除/引用 No.2276-9 - 2013/08/20 (火) 04:35:43 - ttt ただ、なかあきさんの実験の場合、NaOHなどは目的とする凝集タンパクの状態などにも影響する可能性があると思うので、目的とする事象に影響しないような濃度を決定する作業が不可欠と思われます。

(無題) 削除/引用 No.2276-8 - 2013/08/20 (火) 04:30:24 - ttt H2O2の濃度は1~数％の間違いです。

(無題) 削除/引用 No.2276-7 - 2013/08/20 (火) 04:27:08 - ttt > ありがとうございます。実はMeOHで消してみたのですが、Non-fused mStrawberryは完全に消せたのですが、タンパクとのFusion-proteinが消えなかったので、H2O2かNaOHの方法を試してみたいのですが、この処理は固定後に行うのですか？それとも固定と同時に（4%PFA+100mM NaOHのような）行うのですか？教えて下さい。お願いします。それと時間はどれくらいで行ったのでしょうか？ PFAでの固定後です。今、手元に当時のノートがないので正確な数字は思い出せませんが、そんなに時間はかからなくて10分程度で十分だったと思います。どちらも顕微鏡で観察してるうちに蛍光が減弱していくのが分かるのでご自分でmStrawberryの場合について測ってみるのが良いと思われます。H2O2も正確な濃度は思い出せませんが、数%とかの単位だった気がします。

ｔｔｔさん 削除/引用 No.2276-6 - 2013/08/20 (火) 01:17:13 - なかあき ありがとうございます。実はMeOHで消してみたのですが、Non-fused mStrawberryは完全に消せたのですが、タンパクとのFusion-proteinが消えなかったので、H2O2かNaOHの方法を試してみたいのですが、この処理は固定後に行うのですか？それとも固定と同時に（4%PFA+100mM NaOHのような）行うのですか？教えて下さい。お願いします。それと時間はどれくらいで行ったのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2276-5 - 2013/08/19 (月) 07:52:07 - ttt mStrawberryは試したことが無いのですが、mCherryはかなりしぶとかった記憶があります。メタノール固定くらいではビクともしない、くらいな。 それでも、比較的低濃度のH2O2では直ぐに消えてたし、50-100mM程度のNaOH処理も結構効果がありました。

(無題) 削除/引用 No.2276-4 - 2013/08/10 (土) 06:50:49 - mon 4%PFAで固定後,PBS-glycerolで封入し、いわゆるマニキュアでカバーガラスを固定すると、4℃一晩くらいでEGFPはかなり消光しました。これはEGFPのマニュアル通り。

(無題) 削除/引用 No.2276-3 - 2013/08/09 (金) 21:22:39 - なかあき monさん ありがとうございます。この場合、4%PFAよりもタンパクが変性しやすいのですね。この条件で、misfolded proteinが検出できるかやってみます。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2276-2 - 2013/08/09 (金) 13:23:24 - mon mStrawberryは使ったことはありませんが、EGFPならアセトン固定やメタノール固定で変性し消光しますよ。接着細胞なら、培地を吸い取って-20Cで冷却した100%アセトン(メタノール)を注いで5~10分ほど放置し、アセトンを吸い取って乾燥させます。 ただしタンパクを変性させるので、目的の「misfolded proteinを検出」に使えるか否かは、ご自身でご検討ください。 なかあきさんの実験系が不明ですが、siRNA等でmStrawberryの発現を抑制した方が良かったり？

細胞の蛍光（mStrawberry）を消す（低下）させたいのですが。 削除/引用 No.2276-1 - 2013/08/09 (金) 03:00:10 - なかあき 現在、mStrawberryを恒常的に発現する細胞株を用いて、misfolded proteinの検出を免疫細胞染色で行っています。Proteostatでmisfolded proteinを検出しているのですが（こちらの方が強いので検出はできそうなのですが）、mStrawberryもProteostatも赤色の蛍光であり、できれば、mStrawberryを消失（あるいは低下）させて、よりクリアーな画像にしたいと思っています。有機溶剤（エタノール・メタノール）がよいというような書き込みを見たのですが、具体的な方法をお知りの方がいらしたら、教えていただけないでしょうか？よろしくお願いします。他の染色との兼ね合いもあり、チオフラビンTなどは使わない方法を探しています。

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