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(無題) 削除/引用 No.2269-13 - 2013/09/06 (金) 11:29:32 - エンブリ男 Harmonia 様 私が使っているキットは http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/AM1350 で、由来は大腸菌でした。 Harmonia様のご覧になった論文の内容が当てはまるのなら、 （大腸菌なのでバクテリアの代表格だと思いますが） このキットのE-Pap (E.coli poly A polymerase)も菌内では RNAの分解に働いているのかもしれませんね！！ バクテリアだけでなく、酵母でもmeiotic specific mRNA eliminationに poly A化が働いているというのを見た事が有ります。 ただこれは、まとめのmodel図から察するに、poly A化されたものが分解されているというか、poly A tailが分解のための複合体のリクルートに関わっているということでしたので、poly A 化酵素がRNAse分解活性を持つ事の可能性を提示するものではありませんね。

(無題) 削除/引用 No.2269-12 - 2013/09/05 (木) 08:47:58 - Harmonia poly(A)化は、バクテリアではRNA分解に働くという報告が有ったと思います。 in vitroでも、酵素の由来生物によって、産物RNAの分解が起こる？

(無題) 削除/引用 No.2269-11 - 2013/09/04 (水) 15:12:31 - エンブリ男 mMessage mMachine kit を使ってIVTしたmRNAをAmbionのpoly A tailing kitを使ってpoly A化をするという系でmRNAを調製しています。さらにそのmRNAをマウスの1-cellにインジェクションしています。卵にも打っています。 poly A tail付加前のIVT直後のmRNAを泳動すると綺麗なシングルバンドが出ませんか？ poly A tail化をするとスメアになるのは仕方のない事だそうです。 自分も、質問者様と同じ様に4-5 kbのmRNAでスメアな泳動パターンになるので、ambionのテクニカルに以前問い合わせました。 結果、「そういうもんだ」と言われました。 poly A化の酵素にはRNAse 活性があるらしいです。 suggestされたRNAse inhibitorを入れてpoly A化を行いましたが、これは効果がありませんでした。 スメアの傾向は長鎖のRNAほど現れる気がします。 卵および胚にインジェクションしても発現が確認できること(Flag-tagをつけているので、Flag抗体で免染とWBにて確認）と、テクニカルの返答が上記のようなものだったので、自分はスメアのものを打ち込んで、実験しています。 結論をいうと、IVT直後のmRNAが綺麗なバンドが出るなら、IVTはちゃんとできていているんじゃないかということです。 参考になれば。

(無題) 削除/引用 No.2269-10 - 2013/08/11 (日) 17:01:48 - mu ありがとうございます。 皆様のご助言通り、きれいなDNAを精製しなおして 転写をかけ直している所です。 ところで、（何度も申し訳ないのですが）、 完全長のmRNAが減って、スメア状シグナルがみられる という現象は、polyA付加後に強く見られています。 これはDNA精製度の他、何か考えうる点がありますでしょうか？ 調べた所、どうも、同じmRNAの転写で同じ問題 （polyA付加後にスメアシグナルがでて完全長が少なくなる） が見られるケースがあるらしいのです。 DNA精製で解決すれば大変ありがたいのですが、 もし何かご助言ありましたらお願いします。

(無題) 削除/引用 No.2269-9 - 2013/08/08 (木) 23:26:07 - おお フェノくろですが、フェノールクロロフォルム混液をつかって、その後エタチンでしょうか。ならばフェノールクロロフォルム混液のあと、クロロフォルムだけで処理し、エタチンするとよくなるかもしれません。従来フェノールをして、クロロフォルムでフェノールをそぞいてえたちんするというのが方法論だったとおもいますが、混液をつかってステップを省略すること方法がポピュラーになってきたのではないかと。。。 あとしりかのカラムなどでもいいですよ。 わたしは、飽和尿素を同量いれてエタチンをよくします。あるいみフェノくろよりきれいになります。これはスタンダードのプロとコールにはのってないので、自己責任でとしかいいようがないですが、、、 にっくがはいっているかは電気エイどうでチェックはしているとおもいますが、、、 エタチンの塩はアンモニウムアセテートを使ってはいけませんが(ポリメラーゼ阻害剤なので)たぶん使ってないと思いますが、、、、

(無題) 削除/引用 No.2269-8 - 2013/08/08 (木) 21:20:36 - E フェノクロ、エタ沈後の70%EtOHでのWashはしっかり行なっていますか？ 案外慣れていない人はここで非常に純度が悪くなります。

(無題) 削除/引用 No.2269-7 - 2013/08/08 (木) 11:42:35 - mu 具体的なアドバイスありがとうございました。 早速フェノクロ／３５℃ incubateでトライしたのですが、 どうも変わらず・・。 templateのフェノクロ後の吸光度がいまひとつでしたので、もう一度、 ２回ほどフェノクロをかけてやってみたいと思います。 また、incubation時間は６時間で行なっているのですが、 これは影響する可能性があるのでしょうか？ （同mRNAの転写を行なってきっちりバンドがでている研究者が、 over night incubationだったことと、２時間だと収量が少なく、 非常にバンドが見えずらかったことから長くしております。） nickについてですが、template plasmidは調整し直して使用しており、 seq check後PCR産物templateでも、結果が変わらなかったので 別の理由ではないかと思っています。

(無題) 削除/引用 No.2269-6 - 2013/08/07 (水) 18:26:03 - あかね IVTよくやっています。 まずはtemplate DNAを再度調整してください。DNAの純度が悪いと、今回のような問題がおきます。私は、カラム精製ではなく、制限酵素処理した後にフェノクロ＿エタ沈処理しています。 また、通常37°C反応のIVTを35°に下げると、Polymeraseの途中脱落が少なくなり完全長が多く取れます。この場合、totalの収量も低くなります。しかし、今回は全長が4kとのことなので、それほど大きなmRNAとは思えません。なので、DNAの再調整を強くお勧めします。 Good luck

(無題) 削除/引用 No.2269-5 - 2013/08/07 (水) 18:12:03 - Harmonia Nickが入った鋳型ゆえに短い産物が有るとか？ DNAの純度だけでなく、長いかどうかも気になる。

(無題) 削除/引用 No.2269-4 - 2013/08/07 (水) 16:45:42 - おお 一般的なin vitro transcriptionなら1kbくらいになるとまあまあ収量も減って、中間プロダクトも目立ってきます。実験によるかもしれませんが、全長だけが好ましいことが多いのでたいていはゲルから切り出して生成しています。4kbだとPAGEではキツいのであがロースで精製しないとだめかなぁとおぼろげに思っている次第ですが、、、

(無題) 削除/引用 No.2269-3 - 2013/08/07 (水) 16:15:49 - mu ありがとうございます。 よい結果なのでしょうか？収量は問題ないです。 実は海外の研究者が行なった、同じmRNAの転写後の泳動画像を見たのですが、（同キット使用） 目的サイズのみにがっつりバンドがでて素晴らしい結果だったので、改善点があるのかと思い、お聞きしました。（この研究者にも聞きましたが、レスポンスがなかったので。） 共同研究者に渡し、卵に打つ予定なのですが、どの程度影響するのかわからず、 できるだけいいものをと思った次第です。

(無題) 削除/引用 No.2269-2 - 2013/08/07 (水) 16:03:46 - おお 収量がかいてませんが、4kbで1/2が全長を占めるというのは結構いい結果ではないかと思いますがどうでしょうか。

4kb程度のin vitro転写について 削除/引用 No.2269-1 - 2013/08/07 (水) 15:41:31 - mu 現在poly A tail付きの4kb程度のmRNAのin vitro transcriptionを 行なっています。 一応目的のサイズにバンドが見られるのですが、それより小さいサイズにかけてスメア状のシグナルが見られ、完全長のmRNAが少ない印象です。 吸光度と泳動で濃度チェックした結果、完全長のmRNAはtotalの１／２程度です。 mMessage mMachine kit を使用で、長鎖mRNA合成で推奨されるGTP添加では、 特に違いは見られませんでした。 他にどのような改善点があるでしょうか？ 反応温度を30,20,10℃でそれぞれ行なうという選択肢もあるのですが、 これで改善を経験された方いらっしゃいますか？なにせkitが高いので、いろいろな条件を ふりまくるわけにはいかず、困っております。 ちなみにtemplateの純度は、260/280=1.9 260/230=1.7(カラム精製)です。 これも細かい数字まで気にしていたのですが、今までの結果を見る限り、 それほどクリティカルではないかなあ？という感じがしています。

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