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(無題) 削除/引用 No.2263-12 - 2013/08/08 (木) 08:15:33 - ぺーぺー魚屋さん どの文献を参考にしようかということでしょうか？ そうでしたら、自分であれば……。 １）特殊な事情がなければ多少古くてもいいので、、その分野で一番参考にされている論文 ２）似たり寄ったりの文献であれば、どうしてそういうデータが出るのか把握できる論文 の順番で考えるでしょうか。 何にしろ１）を満たせば聞ける人が居たりとかして、２）は問題にならない場合が多いのではないでしょうか。 あとは、著者に聞くくらいでしょう。

(無題) 削除/引用 No.2263-11 - 2013/08/07 (水) 10:38:20 - R >RT-PCRをしたときに、18Sで補正すると >スタンダードで各遺伝子の絶対量を調べたあとに おそらく、real-time PCRで測定しているのだと思いますが、 18Sと標的mRNAそれぞれのCt値はちなみにどれくらいでしょうか。 18S用のプライマーがおかしいか、templateが多すぎるか。 電気泳動のバンドで定量しようとしているのなら、 プラトーになる前のサイクルをとっているか。

(無題) 削除/引用 No.2263-10 - 2013/08/07 (水) 02:56:06 - コン Qさん 分かりにくい質問で申し訳ございません。 1より高くないとダメではなく、逆で1を超えることがありえないと私は思っていました。RNAのintegrityを確認するときにバンドが見える程多いもので、補正（÷）しているのに、1を超えるものがあるとした場合、そのmRNAもバンドとして検出されるべきだと理論上は考えています。因みに、18S(rat)は約400bpで私が調べたいものはどれも300-1000 bpの範囲内です。 おおさん rtの効率の点でいくらか個々のRNAでぶれがあるでしょうけど、100倍ぶれがあるかというのもありますし、PCRはおそらく増幅効率が理想の1サイクル2倍というのに近づける努力をしているでしょうし、そういういみはわたしもrRNAよりおおいいというのはなっとくいきませんけど、どうでしょう。 私も同じ意見です。実験を組み立てるときに参考とする論文の取捨選択をしなけらばならないと思いますが、その参考として今回は質問させていただきました。因みに、使用しているプライマーはランダムプライマーとoligo dtが入ったものです。

(無題) 削除/引用 No.2263-9 - 2013/08/07 (水) 01:30:52 - おお まあ相対的なものですけど、全体の90%以上をしめるものが、ほかのもの(おそらくそれぞれ1%以下)がそれ以上になるというのは問題を感じるわけで、これは質問者に同意できるところです。 rtの効率の点でいくらか個々のRNAでぶれがあるでしょうけど、100倍ぶれがあるかというのもありますし、PCRはおそらく増幅効率が理想の1サイクル2倍というのに近づける努力をしているでしょうし、そういういみはわたしもrRNAよりおおいいというのはなっとくいきませんけど、どうでしょう。

(無題) 削除/引用 No.2263-8 - 2013/08/06 (火) 21:49:41 - Q ＞その値が18Sで補正した場合、1を超えることが果たしてあるのか疑問に思っています。 何が疑問なのか、頭の悪い私にはわかりませんでした。 1を超えないとダメなの？ あくまで相対的なものじゃないの？

(無題) 削除/引用 No.2263-7 - 2013/08/06 (火) 15:52:53 - おお http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/cms_056618.pdf それと、18sが強く出過ぎないように工夫されたものもありますから、ご自身の実験系をいちどチェックしてみてください

(無題) 削除/引用 No.2263-6 - 2013/08/06 (火) 15:47:26 - おお Oligo dTでRTして。18sを検出しているとかないでしょうね。

(無題) 削除/引用 No.2263-5 - 2013/08/06 (火) 04:08:01 - コン すみません。 話の内容が的を射てなくて。 私が最終的に知りたいことは、RT-PCRをしたときに、18Sで補正するとその値が1を超えることがあるかどうかです。 スタンダードで各遺伝子の絶対量を調べたあとにhousekeepingで補正すると思いますが、その値が18Sで補正した場合、1を超えることが果たしてあるのか疑問に思っています。いろんな論文をみてもコントロールとの相対比で算出しているものが多いかと思います。 取りあえず最も疑っているのはスタンダードですが…

(無題) 削除/引用 No.2263-4 - 2013/08/06 (火) 02:10:32 - おお ...なので tRNAとかだとうーんどっちがおおいんだろう。。。

(無題) 削除/引用 No.2263-3 - 2013/08/06 (火) 02:04:31 - おお 例えば18sのRNAの半分のサイズのRNAが同じ分子の数溶液に存在していたとして、それをえちぶろやバイオアナライザーでサイズフラクしょネーションすると 半分のサイズのシグナルは18sの半分です。 18sと同等の量(分子数で)発現する18sの1/4のサイズのRNAは上記のような検出では、シグナルは1/4になってしまいます。逆にシグナルが一緒なら4倍の量あることになります。 ただし、配列もシグナルに影響しますのでぶれがある可能性はあります。

(無題) 削除/引用 No.2263-2 - 2013/08/05 (月) 17:57:07 - AP >18Sより多く発現している遺伝子がある場合、その遺伝子もバンドとして検出されるのでしょうか？ って、あたりまえじゃないかと思いますが。あればですけれど。 精製したtotal RNA（tRNAはほとんど含まれない）の場合、mRNAは1-2%程度、残りはrRNAですから、mRNAがすべて単一の遺伝子産物だとしてもrRNAの量にははるかに及びません。まあ、すべてのmRNAがシングルバンドになるのなら見えないことないでしょうけれど。

house keeping geneについて 削除/引用 No.2263-1 - 2013/08/05 (月) 16:25:42 - コン ちょっとした疑問で恐縮ですが、18S rRNAより多く発現している遺伝子は存在しているのでしょうか？ RNAのintegrityを調べるときに18sと28sのバンドで確認するかと思うのですが、18Sより多く発現している遺伝子がある場合、その遺伝子もバンドとして検出されるのでしょうか？ 基本的な質問で恐縮ですが、何方かご存知の方いらっしゃいましたらご回答お願いいたします。

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