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(無題) 削除/引用 No.2253-11 - 2013/08/03 (土) 00:24:17 - おお 200bpはEMSAではかなり大きめのプローブともいえるので、シフトしたバンドがかなり上の方にきている印象を持つかもしれません。5%でBPBが流れきるてまえでとめても、真ん中ぐらいにフリーのプローブがきているんじゃないでしょうか。 ゲルを若干薄くするのは手だと思いますそれかT/Cをさげるか。ただ大変扱いにくくなってきます。よく脱気して、重合させると若干ましになりますけど。 シフトしないはずのプローブでもゲルのウェル近くに来るのであれば、あぐりげーしょん、のんすぺなどいろいろ原因がかんがえられます。たとえばひストンだってDNAにつきますよね。 でたーじぇんと(NP-40とか0.1-1%)加える。若干塩濃度をあげる(ただ塩濃度をあげると流れが遅くなります)、非特異てきな相互作用を押さえるためにpolydIdCやtRNAをくわえる。また、核酸のつよいネガティブチャージを中和するのにスペルみじんを加えるなど、ノンすぺにたいして一般的によく使われるものがありますので、プロとコールをいくつかさがして、ご自身の実験で妥当と思われるものをお使いになるといいのではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2253-10 - 2013/08/02 (金) 18:55:18 - 虫の息 タンパク質がアグっている、もしくはアグリかけている、多量体を形成するとか。

(無題) 削除/引用 No.2253-9 - 2013/08/02 (金) 18:34:52 - ありえるかも FITCにくっついている可能性はありますか。（そうならP32を使う） FITC−その蛋白にくっつかないプローブはどうですか？ 蛋白は精製していますか？クルードですか？（蛋白が超巨大コンプレクスならあるかも） 競合DNAはどのくらいまで高濃度入れましたか？　（１０００倍とかいいかも）

(無題) 削除/引用 No.2253-8 - 2013/08/02 (金) 17:37:00 - ツブ プローブのサイズは約２００bp ラベルは FITC ゲルは５％ free probeはきれいに泳動されています

(無題) 削除/引用 No.2253-7 - 2013/08/01 (木) 22:25:52 - おお プローブのサイズはどれくらいですか?ラベルはどの様にしましたか? あとゲルの濃度。 プローブだけ流しても流れないなら電気えいどうに問題がありますね。BPBとかダイを使っているなら、それは流れてますでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2253-6 - 2013/08/01 (木) 21:22:19 - AP 一応、TBEのpHをpHペーパーででもチェックしてみたら？ 100 Vで8 mAは電流量が小さすぎるような気がしますが、そんなもんでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2253-5 - 2013/08/01 (木) 20:52:35 - ツブ アクリルアミドです。

(無題) 削除/引用 No.2253-4 - 2013/08/01 (木) 20:51:13 - Harmonia ゲルはアガロース？アクリルアミド？

(無題) 削除/引用 No.2253-3 - 2013/08/01 (木) 19:50:50 - ツブ biding buffer はpH7.9です。 泳動bufferはx10 TBE を0.6x にして使用しています（pHは未調整）。 ミニゲルで100V低電圧で電流値は8-5mAです。

(無題) 削除/引用 No.2253-2 - 2013/08/01 (木) 19:33:32 - AP まず、バッファーが不適切であるということが疑われます。 pHが低すぎるとか、イオン強度がめちゃくちゃ高いとか。 サンプルバッファや泳動バッファ（どのバッファ系でしょう）のpHはどうなっていますか？ 通電したときの電圧と電流量はどんなかんじ？

EMSA ゲルに入らない 削除/引用 No.2253-1 - 2013/08/01 (木) 18:23:13 - ツブ EMSAでコームにシグナルがあり、ゲルの中に入っていないような状況です。 このような場合、このようなことをしたら効果があった！という方がおられましたら 是非情報をお願いします。 今の所、competitor（dGdC）やタンパク質量を変えても変化がみられません。 Binding bufferは、final で 12 mM HEPES-KOH, 50 mM KCl, 3.5 mM MgCl2, 15% glycerol, 1 mM DTT, を用いています。

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