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(無題) 削除/引用 No.2252-7 - 2013/08/08 (木) 18:16:01 - あう >>DC様 貴重な情報本当にありがとうございます。 NEONも魅力的ですが、FuGENEで７割も入るのは魅力的ですね。 NEONは他ラボが持っていそうなので使用に関しては交渉になりそうです。

(無題) 削除/引用 No.2252-6 - 2013/08/04 (日) 12:59:45 - DEC iPS細胞の株によってはROCK阻害剤が効きにくいのもあるので、 Yを50μM程度で使うのがいいかもしれません。 私がFuGENE HDを使ってリバースｔランスフェクションしたときは、 蛍光顕微鏡の目視で7割程度でした。 NEONは知り合いのラボから教わった設定で、 条件設定用プロトコルの17番(850V, 30mSec, 2pulse)を使って、 生存率が最低でも7割程度、導入効率も7割程度でした。 ただし、観察した時の蛍光強度は、FuGENE HDを使った時よりも 低いように見えました。

(無題) 削除/引用 No.2252-5 - 2013/08/03 (土) 08:49:33 - あう >>私はヒトのES細胞を使っていますが、FuGENE HDを使ってTransfectionをしていました。プロトコルはこちらで公開されています。http://www.cdb.riken.jp/hsct/protocol.html ありがとうございます。私もそのプロトコールを参考にhiPSへの導入をFuGENE　HDで行っておりました。 FACSだと１０％行くか行かないかで、プロトコールだと80%いくと書いてありましたが、実際の導入効率はいかがだったでしょうか？ （RIKENのは蛍光顕微鏡で測定しているようなのでその違いが大きいかもしれませんが） >>エレポに関しては、単細胞にしたときにROCK阻害剤を入れ忘れている可能性はありませんか?当所ではインビトロジェンのNEONを使っていますが、未分化ヒトESに関しては相当低電圧の条件で実施しています。 ありがとうございます。ROCH inhibitorは導入直後ー翌日まで10μMで入れております。BioRADのGENE PULSERでやっておりますが報告されている条件よりかなり定電圧ではやっていますが、それでも ほぼ全滅でまだ至適条件見つけられておりません。 頑張って時間をかけて一千万個細胞集めて全滅したときの落ち込みといえば。。。 どうやらAmaxaやNEONなどにきりかえてみるのもありかもしれませんね。 NEONだと実際の導入効率や生存率はどの程度だったでしょうか？もし差支えなければ教えていただけると幸いです。

(無題) 削除/引用 No.2252-4 - 2013/08/02 (金) 19:04:51 - DEC 私はヒトのES細胞を使っていますが、 FuGENE HDを使ってTransfectionをしていました。 プロトコルはこちらで公開されています。 http://www.cdb.riken.jp/hsct/protocol.html エレポに関しては、単細胞にしたときに ROCK阻害剤を入れ忘れている可能性はありませんか？ 当所ではインビトロジェンのNEONを使っていますが、 未分化ヒトESに関しては相当低電圧の条件で実施しています。

(無題) 削除/引用 No.2252-3 - 2013/08/01 (木) 19:12:30 - あう >>ヒトかマウスか、どちらなのか書いた方がよいのでは? ゲノムに組み込まれるのがいや、ということは一過性の発現で見る実験? 安定株とるならゲノムに組み込まれるか、エピゾーマルベクターじゃないとだめでしょう。 Amaxaなら導入効率高いし、ヒト細胞で安定株とれます。 情報不足失礼いたしました。 ヒトiPS細胞で、ご指摘の通りエピゾーマルベクターで一過性発現させる目的で導入を試みております。

(無題) 削除/引用 No.2252-2 - 2013/08/01 (木) 18:53:20 - まわしもの ヒトかマウスか、どちらなのか書いた方がよいのでは？ ゲノムに組み込まれるのがいや、ということは一過性の発現で見る実験？ 安定株とるならゲノムに組み込まれるか、エピゾーマルベクターじゃないとだめでしょう。 Amaxaなら導入効率高いし、ヒト細胞で安定株とれます。

iPS細胞への遺伝子導入 削除/引用 No.2252-1 - 2013/08/01 (木) 15:04:27 - あう いつも参考にさせていただいております。 当方iPS細胞の実験の立ち上げました。 いま分化誘導を試みておりましてある遺伝子をiPS細胞に発現させるために遺伝子導入を試みております。 出来ればレンチなどのゲノムに組み込まれるウイルスベクターを使いたくないため、エレクトロポレーション(BioRADのgene pulser)やリポフェクション（Lipofectamin, FuGENEHD）などで条件検討しております。 文献やBioRADのHPのプロトコールを参照にエレクトロポレーションをしても、細胞が全滅してしまい、電圧などをいじってもほとんど死んでしまって現在頓挫してしまっています。 またリポフェクションなどでは（GFPをフローサイトで確認していますが）ほとんど導入されず、こちらも高い壁に立ちふさがられております。 もしエレポやリポフェクションなどで成功経験のある方がいらっしゃいましたらなにか教えていてだけると幸いです。

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