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(無題) 削除/引用 No.2250-18 - 2013/08/02 (金) 09:30:30 - dendritic+people おっしゃる通りですね。 要するに非特異的な結合が増える、ということですね。 何か変に考え過ぎていたというか、勘違いしてたんだと思います。 皆さんどうもありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2250-17 - 2013/08/02 (金) 08:59:36 - う FITCがラベルされたことによって取り込みやすくなる ということは、ないんじゃないかって結論で もういいんですよね？ その上で、 どんなタンパク質であれ、DCは非特異的（？）取り込んでいるのを 検出感度を上げれば見えてくる のか、 ＞FITC-デキストラン分子の表面にあるFITCが、遊離のFITCが細胞膜に浸透するのと同じように、とりあえずDCの細胞表面に浸透する、その後DCはそれを細胞内に取り込む のか。 つまり、 過剰のFITCが、「取り込みを促進するのか」or「検出感度を上げるのか」 これをどう見分けるのか？ということは？ 実験的には、 後者の非特異的に光っていることをネガティブコントロールで否定して 目的に実験がどうだって論じるでしょ？

(無題) 削除/引用 No.2250-16 - 2013/08/01 (木) 23:23:46 - R >遊離のFITCが細胞膜に浸透するのと同じように、とりあえずDCの細胞表面に浸透する、その後DCはそれを細胞内に取り込む、そんな事がおこるような気がします。 4度でも？ 膜の透過性とエンドサイトーシスは違うのではないでしょうか。 細胞がactiveな状態であれば、膜との親和性が高まることで取り込みが亢進することはあり得ると思います。

(無題) 削除/引用 No.2250-15 - 2013/08/01 (木) 22:43:55 - おお >[Re:14] dendritic peopleさんは書きました : > 皆さんありがとうございます。 > 確か遊離のFITCを除去しきれていなかった可能性があります。というか、それを確かめてはいません。もはやサンプルは残っていないので、確かめるすべはありませんが、冷静に考えれば皆さんのおっしゃる通りだなと思います。 > > ここから先、蛇足になりますが、またデータのない単なる想像なのですが、もしよろしければお付き合いください。 > > ご存じの通り、エンドサイトーシスの実験ではFITC-デキストランがよく用いられます。DCはマンノース受容体（CD206)を介してFITC-デキストランを受容体依存性エンドサイトーシスで取り込むということになっています。 > しかしこれは、FITC-デキストランが、蛍光検出に十分な程度、適度にFITCで標識されていて、かつその分子の表面にデキストランが十分量露出しているから、CD206を介して取り込まれるんだと思います。そして、もしデキストラン分子の表面をFITCが覆い尽くし、グルコースを隠してしまうほどだった場合どうなるでしょうか？　FITC-デキストラン分子の表面にあるFITCが、遊離のFITCが細胞膜に浸透するのと同じように、とりあえずDCの細胞表面に浸透する、その後DCはそれを細胞内に取り込む、そんな事がおこるような気がします。今回のタンパクの場合もそんなことを想像してしまいました。 もちろん取り込みに関与する部分にラベルが入って邪魔したり、2次的なことが起こることがありますから、ラベルが入る残基の100%ラベルが入るような条件をとらずに5%とか1%とかにして、生理的な機能が乱されるようなラベルのはいった蛋白があっても全体からみてごく一部になるようにするのが一般的な方法とおもいます。 さらにFITCなど色素自身が何かする可能性はネガティブコントロールをとる事によってみれますし、ネガティブコントロールをベースライン(バックグランド)としてデーターを解釈することは可能です。

(無題) 削除/引用 No.2250-14 - 2013/08/01 (木) 19:21:30 - dendritic people 皆さんありがとうございます。 確か遊離のFITCを除去しきれていなかった可能性があります。というか、それを確かめてはいません。もはやサンプルは残っていないので、確かめるすべはありませんが、冷静に考えれば皆さんのおっしゃる通りだなと思います。 ここから先、蛇足になりますが、またデータのない単なる想像なのですが、もしよろしければお付き合いください。 ご存じの通り、エンドサイトーシスの実験ではFITC-デキストランがよく用いられます。DCはマンノース受容体（CD206)を介してFITC-デキストランを受容体依存性エンドサイトーシスで取り込むということになっています。 しかしこれは、FITC-デキストランが、蛍光検出に十分な程度、適度にFITCで標識されていて、かつその分子の表面にデキストランが十分量露出しているから、CD206を介して取り込まれるんだと思います。そして、もしデキストラン分子の表面をFITCが覆い尽くし、グルコースを隠してしまうほどだった場合どうなるでしょうか？　FITC-デキストラン分子の表面にあるFITCが、遊離のFITCが細胞膜に浸透するのと同じように、とりあえずDCの細胞表面に浸透する、その後DCはそれを細胞内に取り込む、そんな事がおこるような気がします。今回のタンパクの場合もそんなことを想像してしまいました。

(無題) 削除/引用 No.2250-13 - 2013/08/01 (木) 18:25:32 - R >未反応のFITC等の胸雑物の蛍光強度を見ているのではありません 私が言いたかったのは、FITC自体はそもそもFSC, SSCでのゲーティングで除かれるでしょうが、 未反応のFITCが持ち込まれて、 DCに(FITC標識タンパクではなく)未反応のFITCがくっついている(取り込まれている)のではということです。 4度での云々の記載から、 本当に過剰に標識されたタンパクなの？ 未反応のFITCが持ちこされているだけじゃないの？ と思いました。

試しに 削除/引用 No.2250-12 - 2013/08/01 (木) 18:20:54 - SE 私も長年DCを扱った研究をしていますが、FITC自身が抗原等の取込みを促進する、もしくは何らかの受容体を介してDC内に取込まれるという経験や印象を持ったことはありません。 恐らく回答されてる方々もご自身の研究経験から、その線はないんじゃないか？という感じなのだと思われます。 そもそも抗体を含め、FITC標識の市販品は多くありますし。 勝手な推測からで申し訳ないのですが、過剰にFITCが標識されたタンパクの精製が不十分なのではないでしょうか？ 恐らくFITC標識試薬をいつもより多めに入れてしまったために、精製における限外濾過カラムのキャパシティーを越えてしまい、フリーのFITCが残ってしまっているように思います（精製方法等が違っていたらすみません）。 FITCくらいの小さな分子は４℃でも容易に細胞内に入ってしまいますよ。 試しにフリーのFITCのみの溶液にDCを懸濁し、４℃においてみて、その後FACSをしてみてください。 FITC無しのものよりシフトするはずです。 なぜそうなるかは生化学等の教科書を読むと理解出来ると思います。 FITC標識タンパクの精製はHPLCでできるとベストですが、過剰に試薬が入った場合などでの限外濾過カラム精製の場合は新しいカラムに複数回通すとよいですよ。

(無題) 削除/引用 No.2250-11 - 2013/08/01 (木) 17:28:55 - dendritic+people 皆さんありがとうございます。もう少し補足させてください。 ﾌﾛｰｻｲﾄﾒｰﾀでは、樹状細胞を標識するのに、例えばR-PE等でMHCｸﾗｽII抗原を標識し、そのMHCｸﾗｽII陽性細胞（＝樹状細胞）のFITC軸の蛍光強度の変化を見ています。ですから未反応のFITC等の胸雑物の蛍光強度を見ているのではありません。MHCｸﾗｽII陽性細胞（＝樹状細胞）の細胞内もしくは細胞表面のFITC量を見ていると思っています。 実験のコントロールですが、タンパク未処理のものと処理したもの、それぞれ4℃と37℃で、MHCｸﾗｽII陽性細胞（＝樹状細胞）の細胞内もしくは細胞表面のFITC量を見ています。教科書的な解釈ですが、4℃で目的とする細胞がFITC標識されず、37℃でFITC標識される、という事は、その細胞がFITC標識タンパクをエンドサイトーシスで取込んだのだと解釈しています。 細胞膜表面か細胞内か？共焦点レーザー顕微鏡があれば確認できるのかもしれませんが、残念ながら我々のところにはありません。　いずれ確認したいと思っています。 ところで、私の最初の質問の仕方が悪かったのかもしれませんが、私が知りたいのは、FITC標識タンパクの細胞内の取込み量を定量する方法を知りたいのではなく、「そもそもFITCそのものが樹状細胞のタンパク取込み能に影響を与えるのかどうか？」ということです。 そもそもﾌﾛｰｻｲﾄﾒｰﾀｰでの検出（また顕微鏡等での可視化）のためにタンパクをFITCで蛍光標識したわけですが、FITCがタンパクに化学的に結合することでタンパクそのもののケミカルな性質に変化を与え、その事が原因で、より細胞に吸着しやすくなっている、またその結果として細胞内に取込まれ易くなっている、そんな可能性がないかどうか？ そんな可能性についてコメントやサジェスチョンをいただければと思っております。

(無題) 削除/引用 No.2250-10 - 2013/08/01 (木) 16:06:17 - R >（ほとんど振り切れるぐらい）シフト 未反応のFITCがきちんと除けていないのでは。

(無題) 削除/引用 No.2250-9 - 2013/08/01 (木) 15:38:38 - mbb フローサイトメーターで表面吸着なのか取り込みなのか 区別できないのならば、顕微鏡で観察してみては いかがでしょうか？ 既に観察されてても取り込みかどうかが判断できない 状況なのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2250-8 - 2013/08/01 (木) 15:22:40 - ~ >過剰に標識されたタンパクは、４℃処理でも、細胞集団がFITC軸の蛍光強度の強い方向にシフト それが、タンパク質あたりのFITC量が多いだけで細胞あたりの導入タンパク質量は変わりないのか、細胞あたりの導入タンパク質量も多いのかが問題なのですよね。 今書かれている情報では、各実験を同時に行ったとも、どのようなコントロールで実験間の補正をしたとも書かれていませんので、振り切れたのが ・実際にタンパク質の導入量が多いため ・バックグラウンドレベルの結合の導入タンパク質についているFITCでも振り切れる ・そもそもFACSの設定を間違えていて振り切れた のどれとも結論づかないでしょう。 �@FITCの付加に影響を受けない蛍光タンパク質を用い、異なるFITCの付加量のものを作製し、蛍光タンパク質で細胞あたりのタンパク質量を評価する �AFITCの付加に影響しない位置をエピトープとする蛍光抗体を用い、細胞内に導入された抗原をICCで評価する 等をうまく行えば、タンパク質へのFITCの付加量と、細胞へのタンパク質導入量の関係を示せるかと思います。

(無題) 削除/引用 No.2250-7 - 2013/08/01 (木) 14:45:56 - dendritic+people 質問者です。もう少し補足説明させてください。 細胞内への取込みを３７℃と４℃で行った場合、FITC量の少ない（適度に標識された？）タンパクの場合は、FITC軸で見ると、３７℃処理で蛍光強度の高い方にシフトし、４℃処理ではほとんどFITC軸の蛍光強度に変化は無いので、３７℃では細胞がエンドサイトーシスでタンパクを取込み、４℃では取込まなかったのだと判断しました。 ところが、再度FITC標識したタンパクを作製した際に、上記の実験で調製したものよりも、かなり過剰なFITCで標識したものができ、それを使って実験したところ、４℃処理でも細胞の集団がFITC軸の蛍光強度の強い方向に（ほとんど振り切れるぐらい）シフトしていることを確認しています。 別のタンパクでも同じ様に、適度にFITC標識されたものでは、４℃処理と３７℃処理の違いがみられるのですが、過剰に標識されたタンパクは、４℃処理でも、細胞集団がFITC軸の蛍光強度の強い方向にシフトします。 フローサイトメータでは、FITC標識したタンパクが細胞の中にあるのか、表面に付着しているのかは区別できず、実際にFITC標識タンパクがどこにあるのかはわからないのですが、少なくとも細胞表面に吸着しているように思われます。

(無題) 削除/引用 No.2250-6 - 2013/08/01 (木) 14:05:34 - HIH 皆さんのSuggestionの通り、適切な考察ができているかどうかは疑問ですが、 現象としてあり得ないとは言い切れないかもしれません。 少し話は変わりますが、FITCそのものは同じような分子量の化合物と比較して皮膚表面から血中への移行性が高いことが知られています。 つまりFITCは細胞膜や組織の透過性が高い可能性があるので、 それによってタンパクを包めば膜透過性が亢進することはあるかもしれません。 参考までに

(無題) 削除/引用 No.2250-5 - 2013/08/01 (木) 12:39:36 - おお うさんと同じようにも思えます。所詮印象ですし、まずはちゃんと検証してはどうでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2250-4 - 2013/08/01 (木) 12:36:32 - う 日本語の理解ができていないだけなのかもしれませんが、 質問者様の言っていることは、当たり前じゃないですか？？？？ 同じ１分子のタンパク質に A, １個標識されているタンパク質 B, ２個標識されているタンパク質 これらのタンパク質をそれぞれ、同じ数だけ細胞が取り込んだとしたら、 FACSで見た場合、 AよりもBのほうが２倍光って見えるはず。 私の日本語の読み取りが間違っているでしょうか？？？？

(無題) 削除/引用 No.2250-3 - 2013/08/01 (木) 11:47:55 - dendritic+people 説明の仕方が不十分でした。非標識というのは正確ではありません。 FITC標識タンパクの細胞内への取込みを、ﾌﾛｰｻｲﾄﾒｰﾀでFITCの発現で検出しています。最初からFITCの蛍光強度が低いタンパクと、同じタンパクでもFITCの蛍光強度がより高いタンパクを比較した場合に、蛍光強度が高い方（＝タンパク表面により多くのFITCが結合しているもの）がより多く取込まれる、もしくは吸着するような印象があります。

(無題) 削除/引用 No.2250-2 - 2013/08/01 (木) 11:32:14 - ~ 標識と非標識の2種類のタンパク質はどのように検出されていて、 その検出系は標識の有無に結果が影響されないのでしょうか？

FITC標識タンパクの樹状細胞への取込み 削除/引用 No.2250-1 - 2013/08/01 (木) 11:25:51 - dendritic people 樹状細胞（マウス骨髄由来もしくはヒト単球由来）にタンパク質を取込ませる際の色々な条件を検討しています。その際、ﾌﾛｰｻｲﾄﾒｰﾀｰで細胞内への取込みを確認するために、例えばタンパク質をFITC標識したりします。それらの実験から気がついたことなんですが、 タンパク質をFITC標識することで、非標識のタンパク質に比べ、より細胞内に取込まれ易くなるような気がするのですが、そんな経験をされた方いらっしゃいませんか？　特にタンパク標識時に過剰量のFITCを用いた場合にその傾向が顕著だという印象があります。 樹状細胞にFITCの受容体があるとは思われません。もしかしたらFITC標識することでタンパク質表面の荷電が変わり、非標識のタンパクと比べて、より多くのタンパク質が細胞表面に吸着し、それがきっかけで取込み量が増えてるんじゃないかと想像しています。もしこんな具合にFITCそのものが樹状細胞のタンパク質取込み能に影響を与えるのなら、その事を考慮して実験結果を見なければならなくなります。 少し漠然とした質問ですがお許しください。何かコメントやサジェスチョンをいただければ幸いです。

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