全10件 ( 1 〜 10 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

御礼 削除/引用 No.2249-10 - 2013/08/05 (月) 14:58:21 - 血清蛋白質の分解 ご回答いただきました 皆様、おひとりずつにお礼を申し上げることはできませんが たいへん有用なアドバイスありがとうございました いただいたアドバイスをもとに早速実験してみます

(無題) 削除/引用 No.2249-9 - 2013/08/05 (月) 12:32:07 - おお 沈殿しているものは確かに私もタンパク質を疑います。一番いいのはプラスみどとかまぜて、血液あり、なしでシグナルを比較してみることではないでしょうか。 あとは血液の量を1/4にしてもサイクルが2回ずれるだけだと思いますが、希釈で検出限界を探ってみてもいいかもしれませんよ。

(無題) 削除/引用 No.2249-8 - 2013/08/05 (月) 10:52:25 - ~ >目的は沈殿ができることでＤＮＡの回収率が減るのを防ぐことなんです >ご指摘のとおり、ＰＣＲがかかって、増えるのは分かっているんですが >もっと、回収量があると思っていまして、おそらく沈殿に巻き込まれているんだと思っています。 回収率の向上が目的なのですね。 順番としては、まず同じ材料でDNAを精製したものについてPCRして、増幅効率を見てみるのが先なのでは？ そこで違いがなければ、沈殿をどうこうする意味がなくなりますし、 回収率の100%はそこに設定されることになるでしょう。 沈殿の同定は定性分析をいろいろと試すのもいいのかもしれませんが、今の時代だとMALDI-TOFMSでしょうか。 100kDa位まで測れますし、壊れたフラグメントのサイズやパターンで物の予想もできます。 ただ、本来の目的がサンプル間の比較であれば今のキットでもできるでしょうし、 回収"量"を増やしたいのであれば、PCRを2回かければいくらでも増やせるでしょう。 回収率がそんなに大事な実験をされているのかが疑問です。

ありがとうございます 削除/引用 No.2249-7 - 2013/08/02 (金) 19:34:49 - 血清蛋白質の分解 〜さん ありがとうございます 目的は沈殿ができることでＤＮＡの回収率が減るのを防ぐことなんです ご指摘のとおり、ＰＣＲがかかって、増えるのは分かっているんですが もっと、回収量があると思っていまして、おそらく沈殿に巻き込まれているんだと思っています。 ご指摘のとおり、沈殿を回収してみて、それが何であるか判明すればいいのですが、沈殿が何か確認する方法はどのようなものがございますでしょうか

(無題) 削除/引用 No.2249-6 - 2013/08/02 (金) 09:31:58 - ~ 島津の推奨プロトコルでも沈殿が出ると島津が答えているということは、島津のキットとは無関係の話になりますね。 >回収量が減るのは問題 目的は、定量性のある増幅産物を得ることなのでしょうか？ それとも、沈殿を出さないことなのでしょうか？ または、精製工程を経ることなく、1チューブでPCRができる系を新規に立ち上げあることなのでしょうか？ Google scholarで "whole blood" "quantitative PCR" で検索すると1万件以上ヒットしますので、単に全血で定量性のあるPCRを行うだけならば、すでに系はあると思います。 また、沈殿を出さないこと自体が目的なのでしたら、一度(ProK処理後の)沈殿の定性分析を行い、主成分を確認された方がよろしいかと思います。 沈殿しているのがタンパク質かを確認する前に、プロテアーゼで沈殿が消えるかを検討し続けるのは効率が悪いでしょう。 それと、おそらくはゲノミックPCRをされているのですよね。 インターナルコントロールとなる配列の増幅と比較することはできないのでしょうか。 十分に熱がかかっていますので、沈殿中のタンパク質が配列特異的に結合する能力を残しているとは考えにくいと思いますが。

血清タンパク質の分解 削除/引用 No.2249-5 - 2013/08/01 (木) 17:21:56 - 血清タンパク質の分解 みなさん ありがとうございます 島津に聞いてみました。沈殿が出るそうです 沈殿がでて、それに試料が取り込まれて回収率が減る可能性があるそうですが そういう定量的なデータはないそうです やはり、回収量が減るのは問題で、PCRの加熱の際に　沈殿を出したくなくていろいろと試行錯誤しているのですが・・・・

(無題) 削除/引用 No.2249-4 - 2013/08/01 (木) 14:26:14 - おお 島津にきいてきる方がいいかもですね。

(無題) 削除/引用 No.2249-3 - 2013/08/01 (木) 14:11:02 - ~ http://www.an.shimadzu.co.jp/bio/reagents/amp/amp050906.pdf こちらだと、全血をそのまま持ち込めるようですね。 おお さんがリンクを張られている方のAmpdirectの推奨プロトコルでも、PCRに使えるとは書かれていても、沈殿が生じないとは書かれていないかと思います。 タンパク質が分解すれば沈殿が出ないという話の根拠はどこから来たのでしょうか？ 細胞膜等の非タンパク質が沈殿してもおかしくないと思いますが。

(無題) 削除/引用 No.2249-2 - 2013/08/01 (木) 12:26:03 - おお ttp://www.an.shimadzu.co.jp/bio/reagents/amp/amp050907.pdf >血液なので、プロテアーゼＫを単に加えるのみですが、 SDSやNaClは加えてないのですか? 血清なんですか、血液なんですか?

血清タンパク質の分解に適した酵素 削除/引用 No.2249-1 - 2013/08/01 (木) 10:52:20 - 血清タンパク質の分解 どなたかご存じでしたら、教えていただきたいです 血清タンパクをプロテアーゼＫで分解しているのですが どうも分解が不十分？みたいで、血液を加熱しますと沈殿します プロテアーゼＫがそんなに細かく分解しないものなら、ほかにいいプロテアーゼとかあるものでしょうか？ 血液なので、プロテアーゼＫを単に加えるのみですが、何かプロテアーゼＫの活性向上のために必要な試薬を加えたほうがよろしいでしょうか？ 実験として、島津のキットで血液をダイレクトにＰＣＲにかけようとしています

全10件 ( 1 〜 10 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---