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(無題) 削除/引用 No.2248-9 - 2013/08/02 (金) 04:43:35 - 独り言 リバイス中でしたか。 ちなみにフォスタグは、とても便利な物だけど、泳動とブロッティングの条件がトリッキーなので、過去の掲示板を参考にするとよろし。

(無題) 削除/引用 No.2248-8 - 2013/08/01 (木) 23:46:13 - 不勉強院生 みなさま、ありがとうございました。 大変勉強になりました。 ポイントは「分離して、同一の抗体で染める」という点ですね。 納得いたしました。 phos-tagは名前を聞いたことぐらいしかなかったのですが、 手持ちのマテリアルで直ぐに行える点で皆様がおっしゃる通りfirst choiceとしては良い選択だと思いました。さっそく試薬を注文してやってみます。 また、おおさんのアイデアのphos-A抗体によるIPもおもしろいですね。 これですと、明日にでもできます。reviewerが頷いてくれるか定かではありませんがどうなるのか大変興味深いですのでphos-tagとともに行ってみます。 2DやMSはラボにないため、ひとまず保留にします。 これらでリン酸化されたAの割合が求められることは理解しました。 結果が出ましたら、報告させていただきます。 貴重なお時間をどうもありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2248-7 - 2013/08/01 (木) 13:33:21 - 7744 とりあえずやってみるならフォスタグが一番やりやすいのではないかと思いますね。 簡単かどうかは目的タンパクによると思いますが・・・ フォスタグに一票。

(無題) 削除/引用 No.2248-6 - 2013/08/01 (木) 10:14:31 - おお リン酸か抗体でIPしたものを基準にして比較する手も取れるかと思いました。 1つのレーンにリン酸か抗体でIPしたものをながします。リン酸か抗体で検出すると、 IPフラクションにたいする各サンプルのリン酸化した蛋白量がきめられます。例えばそれをリン酸か 非依存的抗体(通常のwbで使われる抗体)でリプローブします。IPフラクションはリン酸かされた蛋白しかありませんので、リン酸か抗体で得られた時の分子数とおなじ数の分子数を検出しているはずです。従ってかくサンプルの 分子の数の比が理論的には示せるはずです。 ただAPさんがいうようにいずれにせよ量に対しての直線性など見ておく必要はあります。 IPでホモマルチマーを作るようなときは、一度変成するような条件にしてIPできるコンデションにもどすとか工夫が必要かもしれませ。

(無題) 削除/引用 No.2248-5 - 2013/08/01 (木) 07:37:31 - AP 両者の抗体の力価が違うはずなので（バンド強度が同じだからといって分子数が同じということにはならない）ので、簡単には行かないと思います。 トータルのAをIPしたり電気泳動で分取して、定量性のあるMSでリン酸化部位を含むフラグメントを比較するとか？　電気泳動でなんとかリン酸化、非リン酸化を分離して（二次元電気泳動？）抗A抗体で検出される強度から導く（分子数と強度に直線性がないので濃度既知のサンプルの検量線が必要）？

(無題) 削除/引用 No.2248-4 - 2013/08/01 (木) 06:41:46 - おお あ、そうか比が2サンプルでの比較でなくって分子数の比をちゃんと求めたいということなんでしょうか。 ということは、検出時に同じ抗体をつかって、同じメンブレン上で検出しないといけないわけですよね。 フォスタグはいい考えかもしれません。 2Dでその燐酸かしたもの、してないもののスポットが同定できるなら、2Dで同じ抗体で検出するとひがだせるのでは。 すこしトリッキーですがIPをかますなら、燐酸か特異的抗体のIPを比較するものを同時にエイどうして、燐酸化に関係なく検出できる抗体で検出すれば数字はでますね。

(無題) 削除/引用 No.2248-3 - 2013/08/01 (木) 03:17:03 - 独り言 おそらくバンドシフトしないようなリン酸化で、リン酸化特異的抗体で検出しているのですか。 濃度存知のリン酸化、非リン酸化のリコンビナントがないとなかなか難しいような。 もしくはフォスタグなどを使って、がんばってバンドシフトさせれば、トータルの抗体で見えるんですが。 もしくは二次元電気泳動で分けるか。

(無題) 削除/引用 No.2248-2 - 2013/07/31 (水) 23:41:43 - おお 絶対的な比でなければ、リン酸化に対して特異性がない(いわゆる普通その蛋白の発現量がみれる)抗体を使えばいいのではないでしょうか。。。 でもそれは理解されていてもおかしくはないので、何か違うところでひっかかってるのかしら。。。

リン酸化タンパク質とトータルタンパク質の量比を知る方法 削除/引用 No.2248-1 - 2013/07/31 (水) 23:30:51 - 不勉強院生 いつも勉強させていただいております。 ウエスタンで、とあるタンパク質Ａのリン酸化を検出しております。 いろいろと理由がありまして、Ａのトータル分子数に対して どの程度の数のＡがリン酸化されているのかを確認する必要がでてきました。 不勉強でありまして、 どのような手法を用いれば（簡単に）比が出せるか検討がつきません。。。 知恵をかしてください。 どうぞよろしくお願いします。 ちなみに分子の絶対数は必要でなく、あくまでも欲しいのは 「phos-A/(non-phos-A+phos-A)の比です。

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