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(無題) 削除/引用 No.2247-9 - 2013/08/09 (金) 20:34:01 - CHIP初心者 emaさん、おおさん、コメントありがとうございます。 うまく伝わっていない部分があったようで、すみません。 クロマチンの断片化は酵素処理で行っております。 おおさんのコメントの通りです。 sonicatorが必要なのは断片化したクロマチンを可溶化するために 核膜の破砕を行うためです。 少なくとも使用しているCSTのキットでは。 実際に酵素処理をおこなって、クロマチンを断片化した後、 可溶性クロマチン分画を回収するために核膜を破砕する必要があります。 この過程において、sonicationが推奨されています（これはクロマチンの 断片化のためのものではないようです）。代替法として、dounce homogenizer でのhomogenizeもプロトコールに提唱されているのですが、 どうも完全な溶解ができていないように見えるのです。実際にhomogenizerで 処理した後、鏡検すると、一部の核は、核膜が壊れずに丸い形で残っているのが確認できます。 この状態で一応、DNAの回収と、クロマチンの断片化を確認したところ、 DNA濃度は一応、100ug/ml程度（50ul)でとれ、 断片化クロマチンも電気泳動すると、150-900bpの範囲で収まっていることが確認できました。 ただ気になるのは、不完全な溶解で、一部のクロマチンは回収できていないのではないかという疑念があるので、どうしたものかと考えてます。 メーカーからはsonicationがbestということでしたので、 emaさんの言うとおり、他の研究室に貸してもらえないか相談しようと 思ってます。

(無題) 削除/引用 No.2247-8 - 2013/08/09 (金) 15:39:56 - おお そにケーたーで断片化するのでなく酵素を使った断片かを考えていらっしゃると思ったのですが、、、

正確な実験なら 削除/引用 No.2247-7 - 2013/08/09 (金) 12:10:27 - ema 酵素系のでやったこと無いので情報的には片手落ちなんですが >不完全な溶解だと、クロマチンの断片化とDNA濃度が十分でも、後の 解析に問題があるでしょうか？ 不完全な溶解で”断片化とDNA濃度が充分”という話が発生するのが不思議です。 やった経験からSonic等の断片化のところが再現性があり、きれいな結果をだす肝のようなものでした。 試行ではここで色々条件をふって、（というかプローブ型投げ込み式の弱いSonic機械での結果が不安定でした）プローブ型だったら強めの出力ができる機械でSonic条件を調整しました。 お金をかけて良いならコバリスのように一定ｂｐできれるような機械（ちなみに同等といわれるネブライザーはサンプルロスと切れ方の安定に苦労しました）を使うくらい気を使いました。 せめて他の研究室でプローブ型のSonicaterを使わせてって頼むことは出来ませんか?（洗えば機械が減るもんじゃないし）

(無題) 削除/引用 No.2247-6 - 2013/08/07 (水) 15:19:35 - CHIP初心者 おおさん、ご意見ありがとうございます。 ビートビーターですか。初めて聞きました。 いろいろあるのですね。 ただ、DNAに傷はつけたくないというのが、 正直なところです。 CSTに問い合わせて、対処法を確認したところ、 キットに付属のクロマチンを溶解するためのバッファーで 30分程度、氷上においてから、Dounce homogeneizerでの 回数を増やしてみればということでした。ただし、それでも 結局sonicationが一番と言うことでした。 メーカーの言う通りにしてみたところ、鏡検である程度の核膜の破砕が確認でき、最終のDNA濃度も一応、メーカー推奨の値に落ち着きました。 ただし、一部の核は壊れず、一部は回収できていないと考えてます（鏡検で一部の核は壊れず、そのまま残っていたため。）。 不完全な溶解だと、クロマチンの断片化とDNA濃度が十分でも、後の 解析に問題があるでしょうか？経験のある方、ご意見よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.2247-5 - 2013/08/04 (日) 09:37:31 - おお グラスビーズを入れたりして、機械的にシャカシャカ降るやつがありましたね、、、ビートビーターとかいうやつでしたっけ。酵母のライセーとも作れるようですから、そういうのでもいいかもしれません。 もちろんグラスビーズを入れてボルテックスで混ぜてもそれなりの破砕効果があります。ただしグラスはDNAがつきやすい傾向にありますけどね。。。

(無題) 削除/引用 No.2247-4 - 2013/08/03 (土) 10:56:51 - CHIP初心者 いつも勉強させていただいてます。 やはり細胞の可溶化がうまくいっていないようでした。 dounce homogenizerで処理した後、一度、ライセートを鏡検してみましたが、 核は形がそのまま残っている状態でした。 その後、追加で針（27G)を通したり、homogeizeを追加したりしましたが、 どうしても核膜が壊れないようです。一度、メーカーに問い合わせてみる次第ですが、やはりsonicatorがないと核膜の破砕は難しいのでしょうか。 どなたか経験のある、ご意見お願いします。

(無題) 削除/引用 No.2247-3 - 2013/08/01 (木) 19:47:36 - CHIP初心者 おおさん、ありがとうございます。 一度homogenousした懸濁液を鏡検して、細胞や核がどうなっているかをまず、確認してみることにします。 バッファーはキットについているものをそのまま使用しているので、変更しにくいので、まずは細い針に通すことを追加で行ってみます。

(無題) 削除/引用 No.2247-2 - 2013/08/01 (木) 03:03:02 - おお homogenizeしたあとで、けんだくえきを酵素処理すればどうでしょうか。あるいはバッファーの塩濃度などあげるとか、シリンジで注射ばりを通してという話もありますが、、、

CHIPアッセイ 削除/引用 No.2247-1 - 2013/07/31 (水) 23:07:12 - CHIP初心者 CHIP初心者です。 ある転写因子のターゲットを調べるためにCHIPで転写因子の結合したDNAを回収し、最終的にはCHIP-seqにするか、あたりをつけているターゲットのpromoterと思われる領域のPCRをするかを考えています。 vitroの培養細胞が対象です。 研究室にsonicatorがないため、酵素処理でクロマチンの 断片化をおこなうCSTのキットを使用して、予備実験を行っているのですが、 十分なDNA濃度が得られません。（そのため、まだどれくらい断片化できたかも評価ができてません）。使用している細胞数はCHIP1回分を4-6×10＾6個でおこなってます。プロトコールの中で、細胞を可溶化するところで1回だけ、sonicationが必要なところがあるのですが、一応Dounce homogenizerでも可能と書いてあるので、Dounce homogenizerを使用して行ってます。 印象としては細胞の可溶化がうまくいっていないのではないかと考えているのですが（細胞ペレットはそれなりにたくさんあるため）、どなたかアドバイスをいただけないでしょうか。 よろしくお願いします。

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