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(無題) 削除/引用 No.2245-8 - 2013/08/01 (木) 12:31:27 - Q ソーティングしても、その後光らなくなる細胞は光らなくなります。

(無題) 削除/引用 No.2245-7 - 2013/08/01 (木) 10:43:33 - masa 皆様、ご回答ありがとうございます。 皆様からの意見を総合すると、 「HEK293Tに遺伝子導入する実験では、GENETICIN（G418）によるセレクションはできなくはないが、お勧めはできない」ということですね。 抗生物質の添加濃度の予備検討についてですが、一応は事前に行い添加濃度を決定しております。 しかし、大まかにしかできていなかったため検討が足りなかったと痛感しております。 今回行っている実験は幸いなことに細胞種を変更しても問題がありませんので、Cos-7やHeLa、HEK293のような細胞種に変更して実験系を組み直そうと思います。それでもうまくいかないようなら、「み」さんのおっしゃられたFACS sortingも検討しようと思います。 貴重なご意見ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2245-6 - 2013/07/31 (水) 16:35:12 - ~ IRESを使っているのに発現が落ちているということは、 ・G418のセレクションが全然効いていない ・目的のタンパク質が細胞増殖に負に働いて、もともと持っていたネオマイシン耐性遺伝子が増幅されたものしか取れてこない あたりの可能性が高いのでしょうか。 >さまざまな終濃度のGENETICINでセレクションを行いましたが の様々な終濃度で親株を処理した場合の生え具合で、どちらがより可能性が高いのかの判断ができるかと。 抗生物質の添加濃度の予備検討をまだしていなかったのであれば、 次回は親株も並べてセレクションすると結果の解釈に役立つかと思います。

(無題) 削除/引用 No.2245-5 - 2013/07/31 (水) 15:58:01 - み G418耐性の話からずれますが、 GFP蛍光を利用してFACS sortingで発現細胞を分取するのもありかなあ。

(無題) 削除/引用 No.2245-4 - 2013/07/31 (水) 15:35:19 - う ＞HEK293Tでも高濃度のGENETICINでセレクションがかけられる 「高濃度」という但し書きがあるので、話としては矛盾は無いと思います。 ただ、机上の話と実際の話は違うと思いますけど。

(無題) 削除/引用 No.2245-3 - 2013/07/31 (水) 12:27:16 - おお >[Re:1] masaさんは書きました : > 『HEK293Tはもともとネオマイシン耐性を持っているためGENETICINでのセレクションには向かない』、という意見と、 基本的にそうだと思います。もしそれでもやるなら、トランスフェクションせずで、死滅するG418の濃度が必要になると思います。

(無題) 削除/引用 No.2245-2 - 2013/07/31 (水) 11:44:04 - 774 largeT遺伝子を導入するのにNeo耐性を使ってたと思います。 masaさんのGenticin添加条件でコントロール細胞は死にますか？ コントロールが死ぬ濃度で、さらにトランスフェクションして生き残ってくるようになれば、 セレクションは可能なのかもしれませんが、私ならやらないですね。 遺伝子導入後に培養時間が延びるにつれてGFPの発現が落ちるのは、 プロモーターのメチル化等々でよく聞く話です。セレクションとは別問題です。

293T細胞のNeo耐性について 削除/引用 No.2245-1 - 2013/07/31 (水) 11:22:15 - masa いつも勉強させていただいております。 現在私はHEK293T細胞を用いて恒常発現細胞株を樹立しようとしています。 導入したい遺伝子とその発現確認用マーカーとしてGFP遺伝子を載せたベクター（導入遺伝子とGFP遺伝子はIRESで繋いでいます）にはネオマイシン耐性が付与されているため、、 トランスフェクション後、さまざまな終濃度のGENETICINでセレクションを行いましたが、細胞は生きているにもかかわらず1〜2週間程度でGFPの蛍光が確認できなくなりました。 そこでHEK293Tについてよく調べてみると、 『HEK293Tはもともとネオマイシン耐性を持っているためGENETICINでのセレクションには向かない』、という意見と、 『HEK293Tでも高濃度のGENETICINでセレクションがかけられる』という意見を目にしたのですが、矛盾しているように思います。 HEK293T細胞にネオマイシン耐性ベクターをトランスフェクションし恒常発現株を樹立することは可能なのでしょうか？ もし、ご経験があればセレクション条件等もお教えいただければ幸いです。

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