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(無題) 削除/引用 No.2243-21 - 2013/08/04 (日) 14:02:43 - おお >[Re:20] うさんは書きました : > 個人的には、 > > 切った方が効率がいいとしても、 > 100倍効率がいいとかあるでしょうか・・・、 > （無いんじゃないかなぁと） > > それくらいの効率の良さが無いなら > 私だったら、細胞を希釈して撒くときに > ２〜３枚多めのプレートを用意する方がまし、と > 判断します。 あ、わたしも本音でいうとそんなところです。。。ただまあ実際比較データーとかしらないので、ちっと掘り下げてからでもと、、、経験上そうだということなら、いい情報だと思いました。

(無題) 削除/引用 No.2243-20 - 2013/08/04 (日) 11:52:52 - う 私はめんどくさいので、環状のままトランスフェクションして stableをクローニングしています。 ぶっちゃけ、きった方が効率が良い悪いと言いますが、 クローニングする作業には大差ないので、 私は気にしていません。 質問者さんのケースでは、 そこまでして切らなくてはいけないの？ って思います。 個人的には、 切った方が効率がいいとしても、 100倍効率がいいとかあるでしょうか・・・、 （無いんじゃないかなぁと） それくらいの効率の良さが無いなら 私だったら、細胞を希釈して撒くときに ２〜３枚多めのプレートを用意する方がまし、と 判断します。

(無題) 削除/引用 No.2243-19 - 2013/08/04 (日) 01:08:39 - おお >[Re:16] 直輝さんは書きました : > 切る場所によって違うというのも不思議。誤差の範囲なのかな…。 > > 個人的には、環状のままで良さそうだなと思いました。 きる位置での違いを示している文献では、効率が悪くなっているやつは、薬剤耐性の発現ユニットの直前できっています。 はしからけずれていったりしてるんでしょうかねぇ。

(無題) 削除/引用 No.2243-18 - 2013/08/04 (日) 01:05:02 - おお インテグレーションには関係ありそうですね。その関係がプラクティカルにポジティブな方に生かせているか、、、なんて思ったりもするわけです。。。 トランジェントでは発現が弱くなると書いたものもありました。 Complexes formed with the linearized plasmid resulted in low levels of expression; less than one third of the cells transfected with the linearized plasmid were visualized expressing GFP. http://www.bionity.com/en/whitepapers/78546/advances-in-transfection-technologies-using-fugene-r-hd-transfection-reagent-with-pcr-constructs.html

(無題) 削除/引用 No.2243-17 - 2013/08/03 (土) 19:00:39 - AP transfectionの効率は変わらないとしても、integration（stable cell lineにする）には関係あるんじゃないでしょうか？　 just curious

(無題) 削除/引用 No.2243-16 - 2013/08/03 (土) 18:04:42 - 直輝 おお様 興味深い論文をありがとうございます。 プラスミドを直線化したからといって、あまり明確な違いは出ないようですね。 切る場所によって違うというのも不思議。誤差の範囲なのかな…。 個人的には、環状のままで良さそうだなと思いました。

(無題) 削除/引用 No.2243-15 - 2013/08/03 (土) 14:46:50 - おお In our hands, linearization of plasmid did not seem to affect transfection efficiency. http://www.jove.com/video/3110/transfecting-and-nucleofecting-human-induced-pluripotent-stem-cells あまりポジティブな書き方じゃないかも

(無題) 削除/引用 No.2243-14 - 2013/08/03 (土) 14:28:03 - おお ttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16889402 ttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2932902/ Lipofectamine系をつかっていますが、示された細胞では細胞によっては2倍程度でその場合目的のもの(示した論文ではGFPとか)がはつげんしている割合はかいぜんがあるかなぁ。、切り方も影響するようで、、、 うーんどうかなぁって感じです。 TFの方法によっても違う結果がでるかもしれませんけど。

(無題) 削除/引用 No.2243-13 - 2013/08/03 (土) 12:12:22 - 直輝 切った方が効率がいいと言われたりしますが、具体的にどれくらい効率がアップするかデータを見たことはありません。 誰か実際に比較した人はいないんでしょうかね？ 制限酵素による切断が必須でないことは事実です。 私は切ってからトランスフェクションする派です（なんとなく）。

(無題) 削除/引用 No.2243-12 - 2013/08/03 (土) 10:19:05 - 193 皆様の意見ですと、環状であろうがあらかじめ制限酵素で切っておこうが、細胞内でも切断される可能性があるから、あらかじめ切っておくのは意味がないという印象でしょうか？ そうであるならば、手間の関係上、環状のままで使用するほうが楽でいいのですが。

(無題) 削除/引用 No.2243-11 - 2013/08/02 (金) 21:55:26 - st 環状、直鎖状共にある頻度でランダムに細胞内で切断されるのは変わりませんが、 環状から直鎖状になったものは切断部位がランダム。 一方で制限酵素で切ったものは大部分が制限酵素により特定の部位で切断された直鎖状のものです。 当然ながら、制限酵素で切断したDNAが更に細胞内でランダムに切断されて2つ以上の断片になる可能性もあるでしょう。 という認識でいましたがどうでしょう？

(無題) 削除/引用 No.2243-10 - 2013/08/01 (木) 22:47:26 - おお >[Re:9] えさんは書きました : > 制限酵素で切るとランダムで切れなくなるのですか？ そうなんですよねぇ。。。 切った方がいいという話は時折きくのですが、、、 ホモろがすりこんびネーションのときとか、コピー数のコントロールとかするときは切るようですけど、、、

(無題) 削除/引用 No.2243-9 - 2013/08/01 (木) 19:00:49 - え 制限酵素で切るとランダムで切れなくなるのですか？

(無題) 削除/引用 No.2243-8 - 2013/07/30 (火) 18:24:41 - 193 ご意見ありがとうございます。 プラスミドを切る切らないに関しては、切っておいた方が細胞内でランダムに切られるよりは良い（目的遺伝子内で切られては困る）というのを聞き、切るようにしています。 また、今回の1 kbpの部分については、どちらでもいいようですね。 手間の関係上、今回は1+9 kbpでやってみようと思います。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2243-7 - 2013/07/30 (火) 14:36:23 - おお ああ、切ったものを精製したあと、両方必要かという話ではなく、切ったあとゲルで精製して分ける必要があるかという話ですね。 それなら、その1kbpがあってもそんなに邪魔になるものではないでしょう。 そもそも切る必要があるのかなぁという気もしますけど。

(無題) 削除/引用 No.2243-6 - 2013/07/30 (火) 09:59:38 - mon 昔はCarrier DNAを入れていたこともありますので、私なら除タンパク・EtOH沈で1kb含んだまま使います。 もっともplasmidで安定細胞株を作製するのはしんどいので、ここ10年ほどはレトロ(レンチ）ウィルスを使っています。

(無題) 削除/引用 No.2243-5 - 2013/07/30 (火) 09:45:24 - qq DNA導入はelectroporationですよね。 エレポの時はリニアでないとダメというのであれば、それも仕方ありませんが、リニアライズは必須か？ということも考慮しても良いかと思いました。

(無題) 削除/引用 No.2243-4 - 2013/07/30 (火) 09:09:28 - 193 ご意見ありがとうございます。 浮遊細胞でトランスフェクション効率が悪いので多くのDNAが必要であり、また、ゲルから切り出しで精製するとロスが多くなってしまうため、影響がないようなら１+9kbpでエタ沈して使用することも考えていました。

(無題) 削除/引用 No.2243-3 - 2013/07/30 (火) 00:50:17 - おお 1 kbp（Amp耐性の一部）を含める理由がみあたりません。。。

(無題) 削除/引用 No.2243-2 - 2013/07/29 (月) 23:44:47 - 直輝 9kbpのみを精製して使用します

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