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(無題) 削除/引用 No.224-4 - 2012/03/01 (木) 13:08:31 - AP 多分、PCR産物がheterogenousなんでしょう。 nested PCRで目的の産物の含有度を高めることは可能ですか。 シークエンスプライマーはPCRプライマーと同じものでしょうか。でしたら、nestedなプライマーでシークエンスするとノイズが減るかもしれません。 またシークエンスプライマーの品質はokでしょうか。合成エラーや分解で長さが異なったプラウマー分子が混在していたりすると、ずれた波形が重なってしまいます。 >dRhodamine terminator cycle sequence kitをお勧めされたのはバイサルファイト処理後なのでGC richであることが理由だと思います。 BigDyeではdGTPの代わりにdITPを使っていることを問題にしているのかな。 dITPを使っているのはむしろGC-richを乗り越えられるようにだと思いますが。 dITP使用で起こる弊害（波形の圧縮など）を嫌う実験用にはdRhodamine terminatorまで戻らなくてもdGTP BigDyeというのが売られているようです。

(無題) 削除/引用 No.224-3 - 2012/02/29 (水) 17:45:22 - ＩＭ AP様ありがとうございます。 波形の乱れと、重なりが主なものです。 dRhodamine terminator cycle sequence kitをお勧めされたのはバイサルファイト処理後なのでGC richであることが理由だと思います。

(無題) 削除/引用 No.224-2 - 2012/02/29 (水) 17:38:55 - AP >dRhodamine terminator cycle sequence kitを使うといいと それはなにか理屈があるんでしょうかね。 BD ver3.1とver1.1では特長が異なる（3.1のほうが長いところもまで波形の強さが安定しているがプラマーに近いところは読めない、1.1は凸凹して読める距離は少々劣るけれど、プライマー直後から読める）のは経験済みですが。 >それでも読めないものはどういった試薬を使えばいいのでしょうか？ 読めないのはどういう症状ですか（波形が出ない・強度が低い、波形が乱れる・重なる　etc.）。それによって手当てするポイントは違ってきます。 直感的には、使うシークエンス試薬の違いではないように思います。標的配列をのPCRで正しい産物が得られていないとか、異なる産物が混じり合っているとか。

dRhodamine terminator cycle sequence kitについて 削除/引用 No.224-1 - 2012/02/29 (水) 13:27:06 - ＩＭ メチル化の実験をしているものです。現在direct sequenceでバイサルファイト処理をした産物のsequenceをしています。 最終的に読めないものはTA cloningしようと思っているのですが、なるべくdirectで読みたいと思っています。 今までBigdye3.1/1.1で読んでたのですが、それでも読めないものはどういった試薬を使えばいいのでしょうか？同じ部署の先輩はdRhodamine terminator cycle sequence kitを使うといいとおっしゃっていますが、本社からの取り寄せで2-3週間くらいかかるみたいです。。。ゾロの試薬や他の方法で何かあれば教えていただければと思います。 よろしくお願いします！！

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