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(無題) 削除/引用 No.2234-22 - 2013/08/01 (木) 04:38:43 - 小児科医師（ゆとり教育） 〜さん　コメントありがとうございました。インサートは特に組み換えがおきやすい配列ではなさそうなので大丈夫そうです。

(無題) 削除/引用 No.2234-21 - 2013/07/30 (火) 17:06:18 - mon >[Re:20] APさんは書きました : > Sol III (一般的には5M KOAc buffer)で止めるのは、ほんとうにsafeなんでしょうか？ EndA-の大腸菌なら1週間ほど4度で保存しましたが、問題なかったですよ(mini-prep)。 Midi（Maxi)-prepのときには、Sol III のあと遠心して（ろ紙でろ過し）上清をとり、RNaseAを加え、4度で一晩〜1週間保存は問題なかったです。 EndA+の大腸菌では、＋Sol III＞EtOH ppt、リンス>TE-RNase処理の間に分解が進んだときがあります。そのため、次回はフェノール処理しないとまずいなと思いました。

(無題) 削除/引用 No.2234-20 - 2013/07/30 (火) 15:32:40 - AP Sol III (一般的には5M KOAc buffer)で止めるのは、ほんとうにsafeなんでしょうか？ この段階ではかなりのNucleaseが生きていますし、積極的に反応を阻害する成分も存在しないはずです。氷水浴で5分以上とか10分以上とか放置というプロトコールが多いと思いますが、わたしはここでいたずらに時間を伸ばすのは良くないと思っています。凍結すればいいのかもしれませんが、そうすることでゲノムDNAを含む沈殿の細断化を起こすことを恐れます。

(無題) 削除/引用 No.2234-19 - 2013/07/30 (火) 15:10:03 - AA 質問者さんの論点からずれてしまいますが、、、、 他の実験との兼ね合いや、あるいは単純に電車等の交通機関の時間等、 どうしても止めなければいけない時というのもあるとは思いますので、 止められる段階とそうでない段階を把握しておくのは有益ではないかと思います。 私自身としては、普段はSol.IIIかイソプロ後のペレットで止めますが、 例えば、RNA実験を同じ実験台でする予定があるとかであれば、 菌体だけ集めて凍らせるかも知れません。

(無題) 削除/引用 No.2234-18 - 2013/07/30 (火) 14:52:54 - おお >[Re:16] 中年さんは書きました : > 通常のアルカリ法なら、soln Iに懸濁した後は、soln IIを入れて５分、その後にsoln IIIを入れてしまえば、４℃もしくは-20℃でずっと取っておけるでしょうから、soln Iに懸濁した時点で止めて取っておこうとするのはどうしてでしょう？ Iをくわえる前後で凍結によって、菌の破砕がより効果的だとおもうのなら、そこで凍結をかませると一石二鳥という"気分"にもなりますし。 まあ好み、どれだけ回収した時点で急いでいるか、(ほかの実験とかで)忙しいか、などありますので、、、選択肢の一つということではないでしょうか。 IIIまで入れてしまえば、そのあとイソプロ、遠心でペレットでとめる手もあるわけですし、止めれるステップの一つということではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2234-17 - 2013/07/30 (火) 11:13:37 - ~ >ベクターはpGEM-T easy vectorを使用しています。 組換えは起こりにくいベクターかと思います。 組換えが起きているのがインサート内の配列に関係する場合はその限りではありませんが。

(無題) 削除/引用 No.2234-16 - 2013/07/30 (火) 00:26:32 - 中年 通常のアルカリ法なら、soln Iに懸濁した後は、soln IIを入れて５分、その後にsoln IIIを入れてしまえば、４℃もしくは-20℃でずっと取っておけるでしょうから、soln Iに懸濁した時点で止めて取っておこうとするのはどうしてでしょう？

プラスミド抽出のタイムリミット 削除/引用 No.2234-15 - 2013/07/30 (火) 00:00:30 - 小児科医師（ゆとり教育） Harmoniaさん　 コメントありがとうございます。ソリューションIの段階での凍結保存は良さそうですね。今後、検討させていただきます。形質転換後の培養は単一コロニーから採取しています。 〜さん　 時々うまく行かないことがあるなーと最近検討して、プラスミド回収の遅れが原因ではないかと疑いました。うまく行かなかったときはいずれもプラスミド回収が数日から1週間後になっています。ただ、うまく行ったときも3-4日後に回収しており、明らかに有意かは不明です。 ベクターはpGEM-T easy vectorを使用しています。特に組み換えが起こりやすいということを聞いたことはないのですがいかがでしょうか。私自身は詳しく知りません。 冷蔵庫保存でRNAが分解されるなどのメリットはあるといえども、やはりプラスミドは早く回収したほうが良いのですね。培養後速やかにプラスミド回収ができるように、実験の予定を組むようにします。コメントありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2234-14 - 2013/07/29 (月) 10:51:52 - ~ >小児科医師（ゆとり教育） 様 >時に複数のシグナルが検出されてまったく読めないことがあります。 これは、翌日以降にプラスミドを回収した場合にのみ起こるのでしょうか？ そうであるかないかで、今後の対応も大きく変わってくると思いますが。 また、シュードウイルスベクターのような、もともと組換えが起こりやすいベクターを使っていませんか？ そうであれば、大腸菌株を変える対応方法も出てくると思いますが。 培養液のまま冷蔵保存で半日くらい置いておくと、RNAが減っていいという人はいますね。 RNAが自己分解することよりも、早くプラスミドを得る方がメリットが大きいと思っているのでやりませんが。 >ニック 様 >インサートをライゲーションして、クローニングする目的のプラスミドは、TE入りで冷蔵保存が良いでしょうか？ よほど感度の高い系を使わない限り、凍結保存と冷蔵保存で、数字で表されるほどのコロニー数の違いは出ることは無いでしょう。 そのため、どちらを選ぶかは、得られるコロニー数以外で評価するのがいいと思います。 （上司の好みとか）

(無題) 削除/引用 No.2234-13 - 2013/07/29 (月) 08:36:20 - Harmonia ぼくはアルカリプレップ法のソリューションI、II、IIIでDNA抽出しており、 ペレットをソリューションIにけん濁後に-30℃凍結保存しています。 ペレットで液体を除いて保存すると、けん濁に時間がかかる気がするので。 300 ml培養などでもそのようにしていて、問題を感じたことはありません。 ところで、 ＞時に複数のシグナルが検出 形質転換後の大腸菌は単一コロニーから培養していますか？

(無題) 削除/引用 No.2234-12 - 2013/07/28 (日) 21:05:51 - 中年 plasmidのfreeze and thawに関しては、以前に関連するトピックがありました。 http://www.kenkyuu2.net/cgi-biotech3/biotechforum.cgi?mode=view;Code=447

(無題) 削除/引用 No.2234-11 - 2013/07/28 (日) 17:45:52 - kazy ＞ニックさん ただ単に通りすがりで読んだだけのペーペーのモノなのですが……。 凍結融解を繰り返すとDNAが傷つくという話は実際あって、理屈の上ではそういうことはあり得ますよね。 ところが、実際上の問題として、そのことにつまずきを感じたことは殆どありません。 たぶん、実際にそういう事象が起こっていても非常にレアな現象である為に、十分に濃度の濃いDNA(数十ng/uLオーダー?)では問題にならないじゃないかと考えています。 その一方でTEに溶かしていても、数週間単位で4度保存したサンプルがdegradationしたことは何度かあります。 カラムで精製した場合はあまり（全く？）くらいませんが、（P/C処理をしなかった）アルカリSDSで精製したものについては大抵は壊れます。 クラボーのDNA精製機を使った時には「一晩で」RNAは壊れますし、DNAも多分何日も持たないんではないかと思いました。 つまり、4度で保存する場合は精製度によってマチマチの結果になるのではないかと思っています。 何が言いたいかと言うことですが、つまり自分がやっていて殆ど問題がない方法であればどんな方法でやっても良くて、自分にとっては凍結保存の方がブレないように思われるということだけです。 DNA保存についての研究であれば真剣に考える必要があると思いますが、手段としての分子生物学をやっていく上では実務的に考えたほうが良いと思います。 これは居るのだったら「今現在の上司」と無意味な衝突をしないでやっていくという意味も含んでいます。

(無題) 削除/引用 No.2234-10 - 2013/07/28 (日) 16:54:43 - ニック 便乗質問させてください。 プラスミドって、凍結融解するとニックが入るので、特に何らかの インサートをライゲーションして、クローニングする目的ならば、 組み込むためのプラスミドは、TEに入れて冷蔵保存する方が凍結す るよりも良いと、当方は昔の上司に指導されました。 もちろん、単にミニプレ等をして、完成したプラスミドを増やす目的 ならば、多少、プラスミドにニックが入っても良いと思うのですが。 昔の上司が言っていたように、インサートをライゲーションして、ク ローニングする目的のプラスミドは、TE入りで冷蔵保存が良いでしょ うか？

(無題) 削除/引用 No.2234-9 - 2013/07/28 (日) 15:39:04 - おお ペレットか、sol Iけんだく後の凍結は菌体を壊す目的でやっている人もいるかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.2234-8 - 2013/07/28 (日) 11:54:15 - AA プラスミド抽出でストップできるステップは、 ・集菌後のペレット ・溶菌後の中和(P3) ・イソプロ沈後のペレット だと思ってます。

(無題) 削除/引用 No.2234-7 - 2013/07/27 (土) 09:36:51 - AP 私も菌体をペレットにして上清を除くか、懸濁バッファー（Solution I)に懸濁してからフリーザーで保存します。 >少量の残ったLB培地に培地を追加すると大腸菌は増えてくるので菌自体が死んでいるわけではなさそうです。 ほとんどの菌が死滅、溶菌していても、わずかでも生きている種があれば殖えますよね。

プラスミド抽出のタイムリミット 削除/引用 No.2234-6 - 2013/07/27 (土) 08:15:59 - 小児科医師（ゆとり教育） おおさん、ご指摘ありがとうございました。次回よりそのように保存します。

(無題) 削除/引用 No.2234-5 - 2013/07/27 (土) 07:31:48 - おお 通常のプラスミド精製の菌回収の次のステップの前で止めるという感覚です。わたしは特に洗ったりはせず、遠心のペレットをそのまま次のステップにもっていくか、凍結するかです。

プラスミド抽出のタイムリミット 削除/引用 No.2234-4 - 2013/07/27 (土) 07:27:28 - 小児科医師（ゆとり教育） TK-1さん、おおさん、ご教授ありがとうございます。確認ですが、 １．遠心の条件は、3000rpm, 3minくらいで良いでしょうか？ ２．ペレットの保存は、LB培地をできるだけ捨てて、残ったペレットを保存と言うことで良いでしょうか。それともPBSなどで洗浄する必要がありますか？

(無題) 削除/引用 No.2234-3 - 2013/07/27 (土) 07:04:39 - おお TK-1さんと同じ意見です。

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