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(無題) 削除/引用 No.2223-12 - 2013/07/29 (月) 12:18:34 - Pumpkin あ、おお様すみません、ちゃんとよく読んでいませんでした。 確かに塩濃度高いですね。 このあたりをどうするか（塩を加えるか、それともDNase量を 増やしてvolumeを小さくするか。。。）、 効果を比較しながら、検討してみます。 結果はまた報告したいと思いますが、 アドバイスいただけましたので、閉めます。 皆様、ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.2223-11 - 2013/07/27 (土) 13:41:07 - おお イオン強度をあげることによって核酸がしりかに吸着するのだと思ってましたが、、、塩を抜くときはアルコールを使いますよね。

(無題) 削除/引用 No.2223-10 - 2013/07/27 (土) 11:53:45 - Pumpkin プロメガ様　おお様 ありがとうございます。 かなり具体的な出典がでてきて、参考になります。 塩はカラムの吸着能にはあんまり関係ないかなぁって 思っていますが（脱塩もカラムの有用性の一つですから）、 DNaseが濃い（蛋白量、非活性いずれでも）と 反応ボリュームが減らせるので、カラムからのRNAロスが防げるのと、 やはりそのあとのwash bufferが大事というところですかね。 とりあえず、色々とトライしてみます。 改めて皆様、ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2223-9 - 2013/07/27 (土) 01:05:48 - プロメガ おおさん、補足ありがとうございます。 パテントによるとDNaseの濃度がかなり高いようです。 http://www.freepatentsonline.com/6218531.html The DNase treatment step in the High Pure RNA Isolation Kit procedure uses a high concentration sodium chloride salt solution. Unfortunately, DNase I is considerably less active in such high salt solutions, and therefore more enzyme must be added to digest the same amount of DNA compared to what would be required in a lower salt buffer. By adding larger amounts of DNase to the silica matrix, one increases the number of contaminants which must be removed from the matrix before the final elution step. DNase Solution 3,500 units DNase I (lyophilized) suspended in 5 μl of water; and 45 μl DNase Buffer (0.04M Tris, pH 8; 0.01 M NaCl; 0.006M MgCl2 ; and 0.01 M CaCl2). This solution was aliquotted into convenient sized portions. Unused portions were stored at -20° C.

(無題) 削除/引用 No.2223-8 - 2013/07/27 (土) 00:11:54 - おお プロメガのバッファーは塩濃度たかいですね。特許とか探ると高い塩濃度で活性が保持されるようなDNaseIの変異体も見られたりするので、もれキュラーバイオロジーグレイドで単品で売られているものは、そのコンディションでさようするかについて慎重になった方がいいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.2223-7 - 2013/07/26 (金) 22:49:29 - プロメガ スピンカラムタイプですが、プロメガのSV RNA kitがメンブレン上でDNase処理をします。 キアゲンのカラムに使えるかはわかりませんが、一応、Bufferの組成がマニュアルにあるので参考にしてみて下さい。確認していませんが、プロメガの他のサイズのkitでも同様かもしれません。 http://www.promega.co.jp/jp/jp_tech/jp_manuals/SVTotalRNA_J.pdf

(無題) 削除/引用 No.2223-6 - 2013/07/26 (金) 22:10:11 - Pumpkin bluehornet 様 やはりwash bufferの段階で再結合するということなんですね。 たいていのDNaseには10×のbufferがついているので、 DNaseを入れた1×溶液をプロトコルの容量いれてみます。 このときにフロースルーしなければ、 カラムの下にロストしないと信じてトライですね。 やってみます。 情報、ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.2223-5 - 2013/07/26 (金) 13:46:52 - bluehornet もうしわけありません。 コピペしてしまったのでQiagenのつもりがことごとくQiqgenになってました。

(無題) 削除/引用 No.2223-4 - 2013/07/26 (金) 13:39:25 - bluehornet 僕も興味があったのでちょっと調べてみたら以下の製品説明を見つけました。 http://www.wako-chem.co.jp/siyaku/product/life/QuickGene/pdf/SPkit/RNA_baiyou.pdf このスピンカラムのプロトコールでは、オンカラムのDNase処理に色々なメーカーのDNaseを用いています。 トラブルシューティングの「（2）RNAの収量が低い、RNAが得られない」のところで、「wash bufferを添加せずに遠心操作を行った」の項があるので、やはりオンカラムのDNase処理中にRNAは解離しているようです。けれども、wash bufferを添加してから遠心すればRNAはスピンカラムに再吸着するようで、製品説明にあるRNA抽出例ではDNase処理あり、なしでは極端な収量の低下は起こってないようです。 QiqgenのRNeasy kitに応用できるかはわかりませんが、オンカラムのDNase処理後buffer RW1を添加（英語版のAppendix DのD4）したときに適当なインキュベーション時間をおけばbuffer RW1の成分がメンブレン中のDNase用のreaction bufferと混ざることによるRNAの再結合が期待できるかもしれません。 上記の製品説明にはQiqgenの「RNase-Free DNase Set」を使う場合の記述まであるので、ひょっとしたらQiqgenのbufferもそれほど特殊な物ではないのかもしれませんね。 一度適当なサンプルを用いてDNase処理あり、なしで収量等を検討されてはいかがでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2223-3 - 2013/07/26 (金) 12:24:23 - Pumpkin おお様 いつも情報ありがとうございます。 引き続き、アドバイスをお待ちします。

(無題) 削除/引用 No.2223-2 - 2013/07/26 (金) 12:21:15 - おお 確か塩濃度が高いバッファーを使ってたと思いますが、、、詳しい情報でなくてすいません。。。

RNA精製カラムのDNase buffer 削除/引用 No.2223-1 - 2013/07/23 (火) 09:08:08 - Pumpkin いつもお世話になります。 QiqgenのRNeasy kitでtotal RNAを抽出し、 その後DNaseでDNA消化しています。 今回このDNaseを用いて、 オンカラムでDNase処理したいのですが、 オンカラム用のreaction bufferは、 各社開示していません。 そのまま使用すると、 カラムに結合したRNAが乖離して、 溶出されてしまうと思うので、 もし、reaction bufferをご存知の方がいれば、 アドバイスいただけると幸いです。 オンカラム消化の後にエタノールを添加して 再結合させているかもと思ってもいますが、 併せてアドバイスいただければと思います。 よろしくお願いします。

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