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(無題) 削除/引用 No.2216-9 - 2013/07/29 (月) 08:57:41 - MK おおさま もう見ておられないかもしれませんが、 のちのち別の方が検索した際に参考になればと思い結果を報告します。 siRNA濃度を1/2、1/3、1/4と段階分けして施行したところ、1/2でとてもよい結果が得られました。 それ以上の希釈ではターゲットのノックダウンも弱くなってしまいました。 また、ハーベストのタイミングはトランスフェクション開始から72時間後が最良でした。 48時間後でもターゲットのシグナルは落ちていたものの、ネガコンのシグナルもやや落ちていました。 どうもありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2216-7 - 2013/07/22 (月) 14:01:58 - おお >[Re:6] MKさんは書きました : > それも考えていました。 > 一般論として教えて頂きたいのですが、ネガコンsiRNAを用いる意味からして、 > 標的・ネガコンsiRNAは等量等濃度で用いる必要があると考えていました。 > この考え方は間違っていませんか？ もちろん等量で比較するべきです。状況から見てターゲット用のsiRNAはよくきいているようで、WBでも見えるか見えないか程度まで落ちているようです。もしかしたら、作用が飽和するほどの量になっているかもしれません。なのでたとえばターゲットのsiRNAを1/3ぐらいに減らしても、まだ効率的に抑制がかかるかもしれません。 コントロールはもしかしたら非特異な反応でそうすると1/3に減らすと作用が無視できるほどになるかもしれないと思った次第です。特異性に差があるならコントロールと差がでるsiRNAの量(dose)がありそうだということです。

(無題) 削除/引用 No.2216-6 - 2013/07/22 (月) 09:28:37 - MK ウエスタンさま ありがとうございます。「標的に対する非関連コントロール」とは、 標的siRNAで影響を受けないであろうタンパクに対する抗体の種類を増やしてWBを行う、 と理解してよろしいでしょうか。 おおさま それも考えていました。 一般論として教えて頂きたいのですが、ネガコンsiRNAを用いる意味からして、 標的・ネガコンsiRNAは等量等濃度で用いる必要があると考えていました。 この考え方は間違っていませんか？

(無題) 削除/引用 No.2216-5 - 2013/07/21 (日) 07:24:37 - おお もしかしたらsiRNAのトランスフェくションの量を減らすと非特異的な抑制が抑えられるかも。

(無題) 削除/引用 No.2216-4 - 2013/07/20 (土) 20:42:38 - ウエスタン siRNAが効かないことがありますので、要注意。 とくに、蛋白が安定な場合とかが、あなたの言われる場合はあると思います。 全体にコントロールが不足している印象がありますので、最低３種くらいの非関連コントロール（ターゲットに対し）をとるといいかも（ウエスタン）。

(無題) 削除/引用 No.2216-3 - 2013/07/20 (土) 15:44:38 - MK ＞おおさま コメントありがとうございます。 ご指摘の通り、標的・ネガコンともWBで低シグナルのため、差を描出できていない可能性はあると思います。 WBでは総タンパク10ugずつ用いていますが、次回の実験では増量してみるつもりです。 mRNAとタンパクは同時の実験ではありませんが、試薬・細胞数等の条件は同一です。 いずれも3回行って再現性があります。 「ネガコンsiRNA」として販売されている（Silencer® Select Negative Control #1 siRNA）もので、配列は非公開なのです。最悪、別な物を試す必要もありそうです。

(無題) 削除/引用 No.2216-2 - 2013/07/19 (金) 16:47:22 - おお >・ネガコンsiRNAでもタンパク量がおちている >・ネガコンに対して、標的siRNAでタンパク量が落ちていないorWBで検出できない ことです。 WBで検出できないなら、ネガこんより発現量が低いのではないですか? 全てプロとコールが問題ないとしてネガこんで動くなら実験系かネガこんの配列など検討しないといけないかもしれません。 タンパクとRNAは同時に同じコンディションで導入したものでしょうか?そうでなければ各実験でうまくいったりうまくいかなかったりぶれを見ている可能性はありませんでしょうか。 RNAの方の結果は再現性がありますか?

siRNA導入後のタンパク量の変化について 削除/引用 No.2216-1 - 2013/07/19 (金) 15:20:45 - MK RNAi実験の初心者です。Applied biosystems社より標的遺伝子に対するsiRNA、ネガコンsiRNAおよび導入試薬lipofectamin RNAiMAXを購入して実験を行っています。 接着培養細胞（肺がん細胞）にsiRNAを導入し、48h後のΔCt法による定量RT-PCRでは「ネガコンsiRNAサンプルに対して標的siRNAサンプルで90%程度のmRNA抑制効果」および「siRNA非導入サンプルとネガコンsiRNAサンプルではほぼ同一量の標的mRNA発現」を確認しました。 続いてタンパクレベルでの効果を確認すべく、siRNA導入72h後にハーベストしWBを行ったところ、siRNA非導入サンプルと比べて標的siRNA、ネガコンsiRNAサンプル両者で同程度のシグナル減弱を生じており、原因の考察を行っているところです。WBのポジコンとしてβ-actin抗体を用い、3サンプルで同程度のシグナルを確認してあります。 問題は ・ネガコンsiRNAでもタンパク量がおちている ・ネガコンに対して、標的siRNAでタンパク量が落ちていないorWBで検出できない ことです。 乏しい知識で考察すると ・siRNA導入自体が標的タンパク発現に影響を及ぼす。 ・導入からタンパク量変化に要する時間のため、ハーベストのタイミングが悪かった。 などと考えています。ハーベストの至適タイミングを求めるべく24h毎に時間を振って検討する予定ではいます。 これら以外に原因に関するご意見を頂ければと思い投稿させて頂きました。ご教示のほどよろしくお願いします。

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