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(無題) 削除/引用 No.2212-14 - 2013/07/20 (土) 14:22:50 - おお >上司は、制限酵素処理→形質転換での発現→制限酵素処理といった感じで 繰り返すとこのような状態になると言っているのですが unreasonable I do not think it is reasonable, either.

(無題) 削除/引用 No.2212-13 - 2013/07/20 (土) 10:25:53 - 新参者 皆さん、様々なコメントありがとうございます。 頂いたアドバイスを元に、条件検討を行い、再度進めていきます。 私の勉強不足が原因ですが、知らないことも多く、非常に勉強になりました。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.2212-12 - 2013/07/19 (金) 23:13:18 - AP ベクターの種類やインサートの向きを聞いたことの補足をすると、 lacZのなかにクローニングした場合、lacZとインサートのCDSが同方向だとCDSが転写翻訳されてしまうために宿主に負荷を与える場合が考えられるからです。 単にクローニングだけが目的で、インサートの向きが関係ないのであれば、マルチクローニングサイトが逆向きのバージョンのベクターでCDSが逆向きになるようにしたらよいです。 また、ブルーホワイトセレクションを意図してlacZを誘導しているのであれば、それはあきらめて、IPTGを使わないとか、DH5alphaのように誘導なしにlacZが発現する宿主を使わないのがいいと思います。

(無題) 削除/引用 No.2212-10 - 2013/07/19 (金) 22:10:24 - SUmmer-8 根本的な解決にはならないかもしれませんが、 プレートでコロニーができたなら、画線培養は可能でしょうか？ 画線培養で増えなければ、コロニー形成までが限界で溶菌しているんでしょう。 画線培養で増えたら、かき集めてミニプレップに供することができるかもしれませんし、 そうでなくても、今回のトラブルについての何らかのヒントは得られると思います。

(無題) 削除/引用 No.2212-9 - 2013/07/19 (金) 19:44:50 - AP 1. コロニーの段階ですでに死んでいるか死にかけている。 2. 宿主菌は全滅で、生えたコロニーはまったく別の細菌のコンタミ。プレートの上ではかろうじて生えたが、液体培養では無理なやつ（アンピシリンとか嫌気性とか）。 どちらにしても（2は無いと思いますが）、導入したプラスミドが毒性を発現している可能性を疑います。 ベクターの骨格（プラスミド種別）はなんでしょう。インサートは何かの遺伝子のCDSを含みますか？　directionalなクローニングでしょうか（でしたら向きは？） 他に、ねばっとしたコロニー、液体培養の細糸状の濁りの可能性は、 ・ファージに感染？ ・細胞壁が不全？　最小培地で育てた時のように。あるいはリゾチームのコンタミ、あるいはアンピシリン耐性が不十分 まあ、これらはまず無いと思いますが。 >上司は、制限酵素処理→形質転換での発現→制限酵素処理といった感じで 繰り返すとこのような状態になると言っているのですが unreasonable

(無題) 削除/引用 No.2212-8 - 2013/07/19 (金) 16:21:50 - う その、糸を引く、という状態は見てみないとわかりませんが、 プラスミドA、BまたはCをもった大腸菌では、糸が引かないということですよね？ それならばあまり可能性は高くないですが、 大腸菌の培養時、きちんと揺すれていますか？ うまく震盪できていない時、大腸菌が糸状みたいに 塊を形成する時があります。 それを糸が引くと言う人は言うかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.2212-7 - 2013/07/19 (金) 15:34:24 - 中年 糸を引くのは高分子のしるしですので、やはり溶菌してゲノムDNAが出てきているのだと思います。液培で糸状になっているのは、ゲノムDNAに菌体が絡め取られているような状況なのでしょう。

(無題) 削除/引用 No.2212-6 - 2013/07/19 (金) 13:45:03 - 新参者 ＞中年様 コメントありがとうございます。 様々なアドバイスをありがとうございます。 いくつか検討していきたいと思います。 ＞おお様 コメントありがとうございます。 私のコロニーは糸を引いている状態です。 毒性による溶菌以外でも、このようなケースがあるという 認識で大丈夫でしょうか。 皆様、コメントありがとうございます。 現在、液体培地内には、無数の糸のような浮遊物（おそらく、粘度の高かったコロニーが増殖したものかもしれません）があります。 一度これらを回収し、目的物であるかを確認いたします。 いただきましたアドバイスを元に実験を進めてまいります。 また、まだ情報を持たれている方がおられましたら、コメントお願いいたします。 よろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.2212-5 - 2013/07/19 (金) 12:17:34 - おお >コロニーの粘度が高く、液体培地内では塊が液体の中を動いている感じです。 実際にあなたのコロニーの状況を見たわけでないので判断できないですが、コロニーを楊枝などでピックアップしてLBにけんだくしようとすると、糸引いたりとまで極端ではないですが、そんな状態にもなります。軽くぼるテックスすればすぐ分散できますが。

(無題) 削除/引用 No.2212-4 - 2013/07/19 (金) 12:14:42 - 中年 その操作を「制限酵素処理後、大腸菌に形質転換」とまとめるのは不適当で、解決策に近付くための回答は得られませんよ。 それはともかく、プレート上のコロニーの粘度が高いのは、大腸菌が溶菌しているせいだと思われます。お作りになっているプラスミドが、何らかの機構で大腸菌に対して毒性を発揮してしまっているのでしょう。例えば、プラスミドに乗っている遺伝子が発現してしまって、その産物が大腸菌の生育に悪さをしているようなケースが考えられます。 改善策としてすぐに試せるものとしては、例えば次のようなものがあります。 ・遺伝子をlacやtacプロモーターから発現するためのプラスミドなら、誘導前の発現レベルを抑えるために、LB培地にグルコースを加える。 ・プラスミドのコピー数を下げることで毒性を緩和する目的で、形質転換以降の培養を全て30℃で行う。その場合、プラスミドの収率はもちろん低下します。 ・プレートでコロニーがきちんと育つのであれば、液培の代わりにプレート一面にコロニーを出して、それを洗い集めてプラスミド調製に使う。 これはすぐ試せることではないかもしれませんが、毒性のあるプラスミドを増やすために特化した大腸菌株も市販されています。

(無題) 削除/引用 No.2212-3 - 2013/07/19 (金) 11:40:24 - 新参者 コメントありがとうございます。 培地ですが、アンピシリンが100μl/mlで入っているLB培地を使用しています。 実験の流れですが、 1.インサートＤＮＡの調製 　プラスミドＡよりある断片をＰＣＲにて増幅 2.ベクターＤＮＡの調製 　プラスミドを制限酵素でdouble digestionする。 　ゲル切り出しによりＤＮＡ回収 3.増幅した断片とベクターＤＮＡのライゲーション 　（In Fusion Cloning kitを使用） 　大腸菌に形質転換し、LBプレートにまく。 4.構築物を大量調製 5.インサートＤＮＡの調製 　プラスミドＢよりある断片をＰＣＲで増幅 6.ベクターＤＮＡの調製 　4で調整したプラスミドを制限酵素でdouble digestionする。 　ゲル切り出しによりＤＮＡ回収 7.ライゲーション、形質転換 　5と6で調整したインサートとベクターとのライゲーション 　（In Fusion Cloning kitを使用） 　大腸菌に形質転換し、アンピシリン入ＬＢプレートにまく。 8.形質転換体からプラスミド抽出 9．インサートＤＮＡの調製 　プラスミドＣよりある断片をＰＣＲで増幅 　ＰＣＲにて目的のバンドが確認できたら、酢酸Naを加えて、エタ沈 　沈殿を乾燥後、滅菌水で溶解し、制限酵素でdouble digestion 10.ベクターＤＮＡの調製 　8で得たプラスミドを制限酵素でdouble digestion 　ゲル切り出しによりＤＮＡ回収 11.ライゲーション、形質転換 　9と10とのライゲーション。 　In Fusion Cloning kitは使用せず、通常のライゲーション 　大腸菌に形質転換し、ＬＢプレートにまく。 12.シングルコロニーを液体培地にて培養。 今、11と12で止まっています。 理由は、ＬＢプレートにあるシングルコロニーの粘度が高く、 液体培地内で上手く培養できないためです。

(無題) 削除/引用 No.2212-2 - 2013/07/19 (金) 10:57:52 - ~ まずは、何が含まれている寒天培地でできたコロニーを、何が含まれている液体培地で培養したのかの情報を出されては。 >目的遺伝子を制限酵素処理後、大腸菌に形質転換を行っています。 >制限酵素処理→形質転換での発現→制限酵素処理といった感じで繰り返す 制限酵素処理後に形質転換ということは、直鎖ＤＮＡを大腸菌に入れているのでしょうか？ 特殊な系なのか、根本的におかしな操作をしているのかがよくわかりません。

大腸菌の培養について 削除/引用 No.2212-1 - 2013/07/19 (金) 09:57:52 - 新参者 目的遺伝子を制限酵素処理後、大腸菌に形質転換を行っています。 しかし、プレート播種後、シングルコロニーは形成されるのですが、 その後の、液体培地での少量培養で大腸菌が増えません。 使用しているコンピテントセルは、アンピシリン耐性を持つ、 JM109 Competent Cellsです。 コロニーの粘度が高く、液体培地内では塊が液体の中を動いている感じです。 このような状態での解決策はございますでしょうか。 上司は、制限酵素処理→形質転換での発現→制限酵素処理といった感じで 繰り返すとこのような状態になると言っているのですが、初めての体験で、 本当にそのようになるのか分かりません。 何か情報をご存知の方、よろしくお願いいたします。

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