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ご報告 削除/引用 No.2209-11 - 2013/11/12 (火) 12:45:35 - K お久しぶりです。報告を忘れていましたので、恐縮ながら遅れて書き込みます。 タグの開始コドンの手前をKozak配列にしたところ、ばっちりM2抗体で認識しました。 Kozak配列が重要というよりは、開始コドンがスルーされやすい配列になっていたのだと思います。 （冷静に考えれば、リボソームが入り込んでも、タグの開始コドンの直前に終止コドンがあればそこで外れてしまいますよね。。。） みなさま、ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2209-10 - 2013/07/21 (日) 13:15:27 - K お礼を忘れました、すいません。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2209-9 - 2013/07/21 (日) 12:58:23 - K みなさま、全て拝読致しました。 Kozak配列は盲点でした。実はFlag開始コドンの直前が終止コドンになってしまっていてそのままタンデム化は難しいな、と思っていたところで、たしかにその部分はKozak配列になっていません。そのように作り直そうと思います。どうもこの問題が犯人のような気がしてきました。 flag抗体はSigma M2ですが、同じ環境で既にworkしているものですので外れということはないと思います。

(無題) 削除/引用 No.2209-8 - 2013/07/20 (土) 11:59:06 - おお ただ、違った抗体で検出していて、よわい、強いを論じるのは注意が必要かもしれませんけど。

(無題) 削除/引用 No.2209-7 - 2013/07/20 (土) 11:57:06 - おお pCSII-CMVで自分でFLAGtagの開始コドンM以降をおりごかなにかで入れてつくったなら、それが効率的に認識されていないため、あなたの蛋白の開始こどんからtranslationがドミナントに始まっている可能性がありますね。

(無題) 削除/引用 No.2209-6 - 2013/07/20 (土) 09:08:18 - ぽにょ 抗flag抗体には、あたりはずれがあるという話を聞いたことがあります。

(無題) 削除/引用 No.2209-5 - 2013/07/19 (金) 11:15:51 - ｚｚｚ 私は、強制発現させる場合は、 リーキースキャニングを避けるために 開始コドン前の部分のKozak配列を付けてます。

(無題) 削除/引用 No.2209-4 - 2013/07/18 (木) 21:04:03 - K >Harmoniaさん ありがとうございます。 目的の蛋白においてそのような既報はないようです。しかし論文になりにくいことかとも思います。 タグが必ず切られるか、ということですと、N末Flagをつけた論文は散見されるので不可能ではなく、Flagと標的蛋白との間にスペーサーの配列を入れるとまた違うかもしれませんが... >中年さん その可能性はあると思いました。タグをかえたうえで開始コドンも抜いてしまおうかと思っております、ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.2209-3 - 2013/07/18 (木) 20:47:21 - 中年 FLAGの開始コドンより、そのタンパク質本来の開始コドンからの翻訳効率の方が高かったからではないでしょうか。私がＮ末端にエピトープタグを付加する際には、本来の開始コドンを除くようにしています。

(無題) 削除/引用 No.2209-2 - 2013/07/18 (木) 20:39:13 - Harmonia そもそもN末が切り落とされるタンパクってことは無いですよね？ ＞1-18アミノ酸をエピトープとして ということだから、無いと思いますが。

FLAG標識はときに切断される？ 削除/引用 No.2209-1 - 2013/07/18 (木) 20:16:07 - K 宜しくお願いします。 N末にFlagタグがついた蛋白をプラスミドのlipofectionで293T細胞に発現させwestern blotしたところ、とてもシグナルが弱く、stripping→標的蛋白の1-18アミノ酸をエピトープとして作られた普段使っている抗体でre-blotしたところ、いわゆる強制発現らしい強いシグナルが得られました。 M2抗体はラボ内で既定の条件でworkしており、プラスミドはシーケンス済みで、Flag配列が残っていることも確認されました。 ベクターは実はウイルス用の発現ベクター(pCSII-CMV)で、上記は発現の確認実験でした。 プラスミドに問題がなく、workするはずのM2抗体で発現を検出できず、開始コドンを含むN末をエピトープとした抗体で発現が検出できるとすると、目的の蛋白のFlagが検出しにくいか、もしくは発現後に切断されている？と考えたのですが、ご経験のある方はおられますでしょうか。

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