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(無題) 削除/引用 No.2205-9 - 2013/07/18 (木) 18:08:37 - qq GFP融合タンパクをトランスフェクトして、安定株（？）を拾ったりする時に、強く蛍光のあるコロニーと蛍光の弱いコロニーがあって、強く蛍光のあるコロニーをクローニングするわけです。 悪夢のようなことですが、強く光るコロニーの細胞からリクローンした細胞で、再びGFP蛍光の強弱が出てくることは、それほど不思議なことではありません。そうすると、GFPを発現していると信じている細胞株が、実は殆ど親株と区別できなくなっていることも、場合によっては有るかなあと思うわけです。なんせ、NIH3T3の親株の自家蛍光と区別するのが難しいということですのでね。 私は誘導発現系に変えると、このような悪夢が殆ど無くなったので、ある種のGFPの毒性だったり、CMVプロモータの特殊な抑制（マウスでは有るとinvitrogenは言っている）だったりが有るのかなあと思っています。

(無題) 削除/引用 No.2205-8 - 2013/07/18 (木) 17:54:27 - みか ~さん、qqさん お返事ありがとうございます > > > > > あ、これは発現株で何を見るのでしょうか？ あるタンパク質にGFPをfusionさせたものです。 > > > 野生型で（まれに）見られる非特異のシグナルと、発現株の中の低発現のものから得られるシグナルで、後者の方がシグナルが弱いのでしたら、 > > > 前者を数えてしまってでも、後者を拾ったほうがいい場合もあるかもしれません。 申し訳ございません。この点についてはよく分からなかったので、どういう意味かもう少し詳しくご説明頂いてもよろしいでしょうか。 > > > > >[Re:4] qqさんは書きました : > > > ＞ＧＦＰ発現細胞（NIH3T3) > > > が、GFPを発現していないと言う可能性はないのですよね？？ FACS AriaでWTと比較して、明らかにGFP positiveと思われるpopulationをソーティングしています。また、蛍光顕微鏡を用いても確認しております。 > > > >[Re:3] ~さんは書きました : > > > これは1回の実験内の話なのでしょうか？ > > > それとも、日をまたぐような実験の話なのでしょうか？ > > > > > > 1回の実験内の話であれば、同じ処理をした野生型で十分ネガティブになる条件を選び、その条件で発現株を測定すればいいでしょう。 > > > 今回の実験は一回の実験内で見ています。やはりどの野生型細胞をとっても蛍光が検出されない条件でやるべきですよね。。。 > >

(無題) 削除/引用 No.2205-5 - 2013/07/18 (木) 17:31:55 - ~ あ、これは発現株で何を見るのでしょうか？ 野生型で（まれに）見られる非特異のシグナルと、発現株の中の低発現のものから得られるシグナルで、後者の方がシグナルが弱いのでしたら、 前者を数えてしまってでも、後者を拾ったほうがいい場合もあるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.2205-4 - 2013/07/18 (木) 17:30:01 - qq ＞ＧＦＰ発現細胞（NIH3T3) が、GFPを発現していないと言う可能性はないのですよね？？

(無題) 削除/引用 No.2205-3 - 2013/07/18 (木) 17:20:27 - ~ これは1回の実験内の話なのでしょうか？ それとも、日をまたぐような実験の話なのでしょうか？ 1回の実験内の話であれば、同じ処理をした野生型で十分ネガティブになる条件を選び、その条件で発現株を測定すればいいでしょう。 日をまたぐような実験の話であれば、日をまたいだ”基準”は作らずに、毎回野生型も測ってどのセシティビティで測定するかを判断した方がいいかと思います。 何回か繰り返して測定すれば傾向がつかめるかと思います。 ただ、次回の測定も野生型がそのバックグラウンドであることを検証するのは困難です。

(無題) 削除/引用 No.2205-2 - 2013/07/18 (木) 13:48:32 - おお あなたの実験のコンデションでありうる一番厳しい条件を選ぶのが普通ではないでしょうか。

コンフォーカルでのGFP発現細胞観察 削除/引用 No.2205-1 - 2013/07/18 (木) 13:00:14 - みか いつも勉強させていただいています。 コンフォーカル顕微鏡でＧＦＰ発現細胞（NIH3T3)の蛍光を見る際、野生型のNIH3T3（蛍光を発しない）を用いて、蛍光が検出されないセンシティビティ（％）を見つけ、そのセンシティビティを基準にしてＧＦＰ発現細胞を観察するのですが、野生型といっても、５０%で蛍光が見えなくなるものもあれば、４０％、３０％のものもあり、どれを基準にすればいいか分かりません。 理想的には、今現在見ているGFP発現細胞からGFPを抜いた場合の細胞を用いて、蛍光が観察されなくなるレーザー強度を探せばよいのでしょうが、理論上困難ですので、野生型のNIH3T3を用いて実験を行っています。 上記の質問に関しまして、ご教授お願いします。

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