BioTechnicalフォーラム [HPLCで8-OHdGを測定するためのDNA抽出]

HPLCで8-OHdGを測定するためのDNA抽出

No.2181-TOPIC - 2013/07/08 (月) 14:34:48 - ゆきあき

培養細胞からDNA抽出し、HPLCで8-OHdGを測定するように言われています。
私自身はHPLCは初めてで、DNA抽出も過去に数回しかやったことがないレベルです。

1x10^7cellsから和光純薬のDNA Extractor WB Kitで抽出したところDNAらしきものは抽出できたのですが、粘度が高く(ゼリー状で）、希釈が出来ず、吸光度計で濃度や純度が測れませんでした。
（このまま測定すると吸光度が振り切れてしまいます）

しかしこのゼリー状のままヌクレアーゼP1やアルカリフォスファターゼ処理を進めると、最後はフィルターを抜けて溶液が回収できました。

そこで諸先生方にご教授していただきたいことがございます。

このようにゼリー状に抽出されてしまう場合、何か手順が間違っているなどの可能性はありますか？
またこのようなDNAでもHPLCで8-OHdGを測定できるなら、DNAの濃度や純度はどのように吸光度計で測ればいいのでしょうか？
濃度や純度にはあまりこだわらなくてもいいのですか？

前任者がすでに退職し、上司も培養細胞を扱ったことがないので相談できる相手がおらず困っております。

お忙しいところ恐縮ですが、ご教授よろしくお願いいたします。
　

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お礼（〆ます）

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No.2181-5 - 2013/07/09 (火) 13:02:24 - ゆきあき

お忙しいところ諸先生方、コメントありがとうございました。

～先生
スケールアップしておりますが、メーカーさんからこれ以上はお勧めしないと言われてしまいました。スケールアップするなら処理する細胞（ボトル）の数を増やしてDNAを濃縮するように言われました。
濃度や純度の測定法や考え方のご教授、ありがとうございます。
参考にさせて頂きます。
酵素処理はうまくいっているのかもしれないので、一度インジェクションしてみようかと思います。
（私は初心者なので未だにインジェクションさせてもらっていないので。。）

おお先生
そのような方法もあるんですね！知りませんでした。これなら測定できそうなので試してみます。

qq先生
培地中の8-OHdGは測定したことがありません。
（というか細胞から抽出したDNAもまだ測定していなくて。。）
培地中にも出てくるんですね。非常に興味深いです。
ご教授ありがとうございます。

私の初歩的な質問にご回答くださった先生方に感謝いたします。
ありがとうございました。
〆ます。

(無題)

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No.2181-4 - 2013/07/09 (火) 09:37:41 - qq

ゲノムDNAをとって、そこのHOdGを測定するご様子。
そこで、ゆきあき様に是非お聞きしたいのですが、
培地中のHOdGや細胞の酸可溶性HOdGを測定されたことはありますか？
つまり、ゲノム中のHOdGが切り出し修復された痕跡のほうが、現在ゲノム中のHOdGよりも量的に多くて検出が容易なのではないかしらということです。

(無題)

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No.2181-3 - 2013/07/09 (火) 01:57:14 - おお

>しかしこのゼリー状のままヌクレアーゼP1やアルカリフォスファターゼ処理を進めると、最後はフィルターを抜けて溶液が回収できました。

高分子のDNAは濃度がたかいと粘性が高くなり扱いにくくなります。さらにバッファーを加えて4度で一晩置いておけばとおもいます。ローテーターなどでゆっくり撹拌しておくとなおいいかもしれません。

どうしてもというなら、ヌークレアーゼ処理を軽くかけて扱いやすい状態になってから定量して、それからちゃんとした条件の元で各処理をすればいいかもしれません。

(無題)

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No.2181-2 - 2013/07/08 (月) 15:09:07 - ~

>何か手順が間違っているなどの可能性はありますか？
DNAの濃度が濃いだけで、ゼリー状になることはあります。
キットの説明書に書かれた細胞数よりも多い細胞を処理されているようですが、
その分スケールアップをしているのでしょうか？
そうでなければ、キットのメーカーが想定しているDNA濃度の2~3倍になっているかもしれません。また、処理しきれない不純物が残っている可能性も高まるでしょう。

>DNAの濃度や純度はどのように吸光度計で測ればいいのでしょうか？
全量を均一に混ぜたうえで一部を取り出し、それを希釈して吸光度計で測ればいいと思います。
うまく混ざらないのでしたら、一部を取り出してそれを希釈して液状にして、その溶液を原液として使う方法もあります。間違えて希釈しすぎた場合のやり直しが簡単になります。
近くのラボにあって借りられるのでしたら、nanoDropのような高濃度のDNAを測ることができる装置を使って測ってもいいのかもしれません。

>濃度や純度にはあまりこだわらなくてもいいのですか？
濃度については、DNA何グラム中に8-OHdGがどのくらいあったという分析をするのであれば、元のDNAの量は重要でしょう。
細胞1個当たりで評価するのであれば、きちんと等分できればDNA濃度自体はこだわらなくてもいいのかもしれませんが、実験系がきちんと動いていることを確認するためには、細胞あたりのDNA量も抑えておいた方がいいかと思います。

純度については、酵素処理が阻害されるようなことがなく、HPLCで分離した際にピークが被らなければいいでしょう。酵素反応はうまくいっているようですし、ピークが被ることはあまりないと思います。

HPLCで8-OHdGを測定するためのDNA抽出

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No.2181-1 - 2013/07/08 (月) 14:34:48 - ゆきあき

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