BioTechnicalフォーラム [ファージの感染菌について]

ファージの感染菌について

No.2171-TOPIC - 2013/07/05 (金) 17:09:20 - クロ

ファージの増殖行うことになったのですが、そのような操作をした経験がないため、意見をいただきたく書き込みました。

ファージを増やすにあたり、感染させる大腸菌は皆さん何を使っていらっしゃいますか？これが良いといった株があるのでしょうか？それともどれでもよいといった感じですか？

形質転換用のJM109やDH5αはあるのですが、それを使うのはもったいない、または、やめたほうが良い等、不都合な点はありますか？
　

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No.2171-15 - 2013/07/10 (水) 19:28:55 - AP

>制限システムを含まないSURE

これは、哺乳類などCpGメチル化を受けたゲノムDNAからprimeary libraryを作製するときに関係します。メチル化を受けたゲノムDNAが制限によってクローニングできないことを防ぐためです。一旦、大腸菌で増やされ単離されたファージクローンのDNAには関係ありません。

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No.2171-14 - 2013/07/10 (水) 19:23:37 - AP

まずprimary libraryを感染させるのではなく、単離したクローンの増殖だけということですのでSpi selectionは必要ない、つまりP2 prophageのない宿主を使用できますので、rec系の欠損株は使用可能です。

しかし、インサート内に同方向反復配列、逆方向反復配列など不安定な構造がない限り、rec-にはこだわらなくても大丈夫です。
SUREはrec系の三重変異だか四重変異だかで、非常に不安定なインサートでも保持できる可能性があるというのが売りですが、増えにくいし、そこまで必要になるインサートに当たることはめったにないので、ファーストチョイスにはおすすめしません。

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No.2171-13 - 2013/07/10 (水) 18:51:22 - クロ

何度もすみません。

さらにお聞きしたいことがあります。

いろいろと調べていたところ、組み換えも起こらず、制限システムを含まないSUREが良いかな？と思っていたのですが、様々なプロトコル等を見たりするとそれ以外の大腸菌が使われていることも多く見受けられました。そのため、あまり気にする必要はないのかな？と思ったりもしています。

制限システムの有無等はファージ増殖、外来ＤＮＡの安定性にどの程度影響を与えるものなのでしょうか？

ファージに含まれるＤＮＡは植物由来のＤＮＡで、増幅した後、シーケンスを行う予定なので、rec-のものにしようとは思っています。

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No.2171-12 - 2013/07/10 (水) 13:57:34 - クロ

目的は、シングルクローンをサブクローニング用に増やすことです。

詳細まで教えてくださりありがとうございます。とても勉強になりました。

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No.2171-11 - 2013/07/05 (金) 23:07:41 - AP

>シングルクローンをサブクローニング用に増やす
であれば、今ならPCRで増やしてしまうというのも一案ですが。

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No.2171-10 - 2013/07/05 (金) 22:46:40 - 中年

ところで目的は？

例えば、ライブラリーを増幅するのと、シングルクローンをサブクローニング用に増やすのとじゃ、ハードルの高さが全然違いますよ。

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No.2171-9 - 2013/07/05 (金) 20:06:21 - AP

ついでにいうと
lambda phageの宿主として良く使われるこれらの系統NM538, LE392, NM539、P2392はrec+。なので、ファージDNAの組換えが心配される場合、rec欠損株
KW251やSUREを選ぶ。ただし増殖は劣る。

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No.2171-8 - 2013/07/05 (金) 19:54:48 - AP

だったらamber suppressor（supEまたはsupF)は必須で、DH5alphaは不可。
JM109はいける、XL1-Blueは多分及第（supEがあるはずだが、情報の出所によってはリストに漏れていることがある）。
通常、EMBL3/4をルーチンで使う場合、宿主は、NM538, LE392, KW251などを用いる。recombinantを選抜しnon-recombinantを排除する必要があるときはP2 prophageをもった系統、NM539、P2392などを用いる。

どの宿主を使うにしても、実用的な感染効率を達成するには、lamB 遺伝子を誘導してlambda phage receptorを発現させておく必要がある。そのためには、宿主菌調製用の培養の時にmaltoseを添加して、maltose operonを誘導する。

詳しくはMolecular Cloning（できれば2nd ed.　なければ3rd）を読んでほしい。

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No.2171-5 - 2013/07/05 (金) 18:07:30 - クロ

ＥＭＢＬ４です。

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No.2171-4 - 2013/07/05 (金) 17:53:12 - AP

株種は？

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No.2171-3 - 2013/07/05 (金) 17:50:27 - クロ

すみません。書き忘れてました。
λファージです。