神経細胞の初代培養を行っています。
薬剤処理後の細胞死を検出するためにTUNEL法に基づいたキットを用いようとしています。
ロシュの「In situ 細胞死検出キット、フルオロセイン」というものです。
プロトコルでは、
・４％PFA固定,室温,１時間
・風乾
などの操作がありますが、現在、マーカータンパク質などの検出の際には、４％PFA固定は27℃，10分の条件で行っており、風乾という手順をはさんだことがありません。
培養は、PLLコートしたガラスボトムの８wellチャンバー（約1cm3）で行っています。
カバースリップではないので、染色や蛍光顕微鏡での観察はwellに溶液が入った状態で行います。
神経初代培養に限らず、底の外せないチャンバーで培養した細胞にTUNEL法のキットを利用したことのある方、
・４％PFAによる固定条件、Triton X-100による浸透の条件
・TUNEL反応液の１well当たりの量
・風乾が必要かどうか
・TUNEL反応液の残りを再冷凍しても使えるか、あるいは冷蔵での保管期限
・観察，保存の際にwellに入れている溶液
・DAPIあるいはPIで二重染色するタイミング
など詳しいプロトコルを教えていただけるとありがたいです。
どれかひとつでもかまいません。
１か月程度の培養が成功しているため、細胞の強度に関しては大丈夫だと思われます。扱っているのはcortex の細胞ですが、どの種類でもかまいません。
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