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(無題) 削除/引用 No.2165-12 - 2013/07/04 (木) 16:41:26 - おお あ、プレートの事とかぎらなかったのね。液体培地は抗生物質なしで滅菌後室温保存です。半年は大丈夫じゃないかなぁ。厳密な実験が必要でないなら。

(無題) 削除/引用 No.2165-11 - 2013/07/04 (木) 10:07:17 - A ampどころか今使ってる抗生剤系は全部作りおきです。 Amp、Km、Cm、Hm、Spc、Em等様々ですが・・・。 液体培地は作りおきしません。そんなに手間じゃないので。 寒天培地は作り置きして3ヶ月は作ります。 ampは100μg/mLで作ってますが、3ヶ月程度では問題ないかな。 大体100枚程度まとめて作ります。

(無題) 削除/引用 No.2165-10 - 2013/07/03 (水) 18:33:10 - イーコ 皆様、重ねての御教授　誠にありがとうございました。 参考にさせていただきます。

(無題) 削除/引用 No.2165-9 - 2013/07/03 (水) 10:42:39 - mon electroporationでSOCを1ml使うと全量dishにまくと染みこまないことがよくあります。 （コンピの性能が良ければ少量ですみますが） このような性能の低いコンピの場合は、寒天培地をクリーンベンチで蓋をあけ30分ほど乾燥させておけば、コンピ50ul＋SOC300-500ul(1mLでも可）で回復させて、それを全量蒔いても1分以内に染みこみますので、逆さにして37℃で保温できます（=直ぐに帰宅できる！）。 なお、SOC 300uLではややコロニー数が少ないような気がします。

(無題) 削除/引用 No.2165-8 - 2013/07/03 (水) 10:34:44 - mon ＜注意＞下記の手抜き法は、クローニングが成功しない場合には真っ先に疑う点であることを忘れないでください。 AmpとKnを汎用しますが、液体培地、寒天培地とも作り置きしていますね。 Ampの方が効果が弱くなるのが早いので100ug/ml添加しています。４℃保存で2ヶ月くらいは問題ないですね。Knは3ヶ月くらいは持ちます。ただしこれも使用頻度や保冷庫の開け閉めの頻度による温度上昇等が影響しそうなので、下段の奥の方に入れるようにしています。Ampの場合、(お薦めしませんが）抗生剤をつぎ足したりもします。 寒天培地は大抵500mlボトルで数本作りオートクレーブ後室温保存。使用時に電子レンジで溶解して10秒ほどなんとか触れるほど冷めたら抗生剤を添加し25mlピペットで20mlずつdishに分注。 クリーンベンチでair flowなしで1~2晩ほど放置して余分な水分を飛ばしたあと、dishが入っていたビニール袋に戻して、余った袋部分をテープで蓋をして、逆さまにして4℃保存。 逆さまにする理由は、水滴がでてきた場合に蓋にたまるようにです。使用時振り捨てています。 多量に使わない抗生剤は、ただのLB寒天培地に、滅菌LBやDDWを100-200uLを垂らしておいて規定量の半量の校正剤（12.5ml相当）を塗り広げ、2-4時間たってから使用しています。一晩おくときは規定量が良いです。Ampならさほど問題ないですが、規定量の半量使うジャンクなやり方は、tet、cmや、特にコピー数の少ないplasmidで失敗する可能性も高いのでご注意ください。

(無題) 削除/引用 No.2165-7 - 2013/07/03 (水) 10:13:11 - おお >[Re:5] イーコさんは書きました : > もうひとつ教えてください。LBアガー培地の場合も、何とかつくりおきをできないでしょうか？ > > たとえば、次のような方法ではいかがでしょうか？ なんか一通りその答えになることを書いたつもりなんだけど、、、 > > （１）通常通りに、アガー入りLBをオートクレーブして、冷めてきたところで、クリーンベンチ内で、濾過滅菌済みのアンピシリンを50ug/mlになるように添加してから、20〜25mlぐらいずつ、プラスチックシャーレにまいて固まらせる。 これはまあそのままですね。。。 > > （２）その後、各シャーレの周囲をパラフィルムでまいて、さらに、ジプロックなどの口を密封できるビニール袋にいれ、水で濡らしたキムワイプを同封して、冷蔵庫に保管をする。 固まらせたあと若干表面を乾かせます。保存中または菌をまいて37度でインキュベーターに入れた時に水分が出てきたりします。また菌をまく時になかなか乾燥しません。 かわかしたプレートは購入した時にパックした袋に入れて密閉かそれに近い状態で保存しておけば大丈夫です。 > > （３）アンピシリンの有効日数が、たぶん１、２週間であることを考えて、１週間以後には、生食に50ug/ml濃度で溶かしたものを、シャーレ全体の上にのせて、数ミリ程度の層にして、５分とか適当な時間をおいてから、液を回収する。その後は、通常どおりに使う。 アンプをあとからくわえるんだったら、最初からアンプを加えないで使う前日にアンプをぬって室温で乾かしておけばいいかと思います。200-300ulあれば全体にまんべんなくぬれるのではとおもいます。プレイとを上向きの状態でおいておけばいいかと。液をくわえて、回収したのでは、液体のバイチの大腸菌をまく時、いっこうに乾かないですよ。

(無題) 削除/引用 No.2165-6 - 2013/07/03 (水) 09:45:14 - ~ 用事調整が好きなボスなのでしょうか。 サブクローニング用であれば、アンピシリン入りLB寒天培地はアンピシリン入りで作って1か月は持ちました。 単にディッシュの入っていた袋に戻して、ビニールテープでふたを閉じるだけで使っていました。 ただ、長期保存すると作製時の操作が悪いとカビが生えます。 抗生物質の効きが悪くなった時は、寒天量を15mLと仮定して、 その分のアンピシリンを上から足して染み込ませたら効きました。 ただ、抗生物質が濃すぎて菌が全滅するようなことがあったら困りますので、お勧めはできませんが。

(無題) 削除/引用 No.2165-5 - 2013/07/03 (水) 09:31:04 - イーコ 皆様、さっそくの御回答、誠にありがとうございます。作り置きをされている方の実践方法はとても参考になりました。 もうひとつ教えてください。LBアガー培地の場合も、何とかつくりおきをできないでしょうか？ たとえば、次のような方法ではいかがでしょうか？ （１）通常通りに、アガー入りLBをオートクレーブして、冷めてきたところで、クリーンベンチ内で、濾過滅菌済みのアンピシリンを50ug/mlになるように添加してから、20〜25mlぐらいずつ、プラスチックシャーレにまいて固まらせる。 （２）その後、各シャーレの周囲をパラフィルムでまいて、さらに、ジプロックなどの口を密封できるビニール袋にいれ、水で濡らしたキムワイプを同封して、冷蔵庫に保管をする。 （３）アンピシリンの有効日数が、たぶん１、２週間であることを考えて、１週間以後には、生食に50ug/ml濃度で溶かしたものを、シャーレ全体の上にのせて、数ミリ程度の層にして、５分とか適当な時間をおいてから、液を回収する。その後は、通常どおりに使う。 できれば１ヶ月ぐらいはもたせたいです。

(無題) 削除/引用 No.2165-4 - 2013/07/03 (水) 08:39:31 - おお >[Re:1] イーコさんは書きました : > オートクレーブ後に冷めてきたところで、濾過滅菌済みのアンピシリンを50ug/mlになるように添加してから、冷蔵庫に保管をすればよいかと考えました。 よいです。というか用時調製と書いているプロトコールがあるんでしょうか。。。 > > このような方法を実施されている方はいらしゃいますか？大腸菌の増殖は低下しますか？また、どのくらいの期間、保存可能ですか？ してます。こうせい物質は寿命がそれぞれ違うとおもいますが、それ以外のバイチの成分なら一年ぐらい持ちそうですが、、、まあ数カ月(半年ぐらいまで)なら大丈夫かと思いますが。 アンプは比較的へたりやすいので、プロトコール集とかには1ー2週間とか書いてますが、まあ2、3ヶ月は何とかなると思います。 こうせい物質を入れない状態でつくって、使う時に添加するというてもあります。

(無題) 削除/引用 No.2165-3 - 2013/07/03 (水) 08:26:39 - Harmonia まずは、研究室の流儀に従ってください。 僕は、１リットルのLB液体培地を作成、 250 ml ビンに200 mlずつ小分け、 オートクレーブ滅菌、 ４℃保存、 そのうち１本にアンピシリンを添加、４℃保存。 どのくらい持つかは統計をとってないので分かりません。

(無題) 削除/引用 No.2165-2 - 2013/07/03 (水) 08:26:38 - TS LBをオートクレーブ、冷蔵庫保管しておいて、使う時にAmpを添加するのが良いと思います。Ampは、冷凍保管しておく。 これなら両方とも数か月はもちます。 Ampの冷蔵保存の安定性は長くないですよ。

LB培地 削除/引用 No.2165-1 - 2013/07/03 (水) 08:07:58 - イーコ クローニングなどを始めた初心者です。どうぞよろしく御願いします。 アンピシリン入りLB培地を毎回毎回調整するのが面倒だし、コストも節約したいので、作り置きをしたいと考えています。できれば調整後に１ヶ月ぐらいはもたせたいです。 オートクレーブ後に冷めてきたところで、濾過滅菌済みのアンピシリンを50ug/mlになるように添加してから、冷蔵庫に保管をすればよいかと考えました。 このような方法を実施されている方はいらしゃいますか？大腸菌の増殖は低下しますか？また、どのくらいの期間、保存可能ですか？ もし他に良い方法を御存じの方、その方法(例、マイナス30℃冷凍）を教えてください。

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