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(無題) 削除/引用 No.2149-9 - 2013/07/07 (日) 12:08:56 - おお >目的の遺伝子はすでにアストロサイトで誘導されることが報告されています。 もう一つ気になるのはこの部分です。どこまで信用できるのか、報告したグループがもしかしたら相当苦労した条件下で出したデーターかもしれませんし、ほかのグループが再現できずに(再現できないからそのグループが間違っているというわけではない)、何かよくわからない違いにより大きくデーターが変わる可能性のあるものかもしれませんし、、、実際何を見ているのかわかりませんので何ともいえませんが、すべて発表されたとおりにいくとは限らないという意識はいつも持っていた方がいいとおもいます。

陽性対照とってますか？ 削除/引用 No.2149-8 - 2013/07/06 (土) 11:24:38 - 月詠 アッセイ系が不安定なときは、系のどこかに不安定な要因が内在しているはずですから、多少遠回りに思っても、きちんと対照実験を行って一つづつ原因を検証する方がよいと思います。 アッセイ系が不安定な原因としては、おおまかに (ア)刺激される培養細胞が不安定 (イ)刺激に用いるIL-1β試料が不安定 (ウ)遺伝子発現の検出系が不安定 の三通りの可能性が考えられますね。 そのうち、質問者さんは(イ)の可能性を考えていらっしゃるようですけど、(ア)や(ウ)の可能性はどのような根拠で棄却されたのでしょうか？ もし(イ)の可能性が真実であれば、IL-1受容体を発現している他の培養細胞を刺激した場合でも、実験結果が不安定になるはずです。 実際にそのような対照実験の結果が得られているのでしょうか？ 他の先生方も指摘されているとおり、それよりは(ア)の培養細胞が不安定な可能性の方を先に疑った方がよいように思います。 たとえば、IL-1受容体とTLR4受容体はMyD88以下の下流のシグナル経路は同じですから、その培養細胞がTLR4系の受容体を発現しているのであれば、LPS等で刺激しても目的の遺伝子発現が観察されるはずです。 LPSで刺激しても結果が不安定であれば、細胞のシグナル伝達経路（ないし受容体発現）に問題がある可能性が高くなります。 逆にLPS刺激で安定な結果が得られ、IL-1βで刺激したときだけ不安定なのであれば、細胞内シグナル経路に問題はなくて、IL-1受容体の発現が不安定か、あるいはIL-1β試料に問題があるということになりそうです。 上手くいかなくて苛立つお気持ちはわかりますけど、そういった見極めをしないで闇雲にIL-1βの品質に拘っても、科学的な論証にはならないと思います。

(無題) 削除/引用 No.2149-7 - 2013/07/02 (火) 10:20:19 - おお 細胞に関しては慎重に考えた方がいいと私も思いますが、同じ実験系を扱ってないとなかなか直接的なアドバイスがしにくいです。 その遺伝子の上昇のほかになにかもっと典型的なよくキャラクタらいずした遺伝子が動くのかとかも見てみる余地はあるかもしれませんが、、、NFkB活性かも指標になる可能せいはあるかもしれませんし。 微量のサイトカインであるとBSAがないと容器への吸着によるロスもあるかもしれません。おおもとがそれなりの高い濃度で溶かしてあるなら(BSAフリーで)BSAのはいったもので希釈してもいいかもしれません。まあ無血清バイチでもタンパク成分は入っているでしょうけど、、、 あと、オートクレーブでバクテリアをオートクレーブした事のある窯をつかうとLPSがコンタミする可能性があるというような指摘もあります。実際質問者様が使っている溶液、容器などでオートクレーブしたものがあれば、そういうのを避ける手はあるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.2149-6 - 2013/07/01 (月) 20:55:14 - pj 気になったので検索してみましたが、G26-24はアストロサイトーマではなくオリゴデンドログリオーマ由来のようですから、この点は問題ないか確認が必要だと思います。

(無題) 削除/引用 No.2149-5 - 2013/07/01 (月) 19:11:32 - alpha G26-24細胞を使用したことがないので、わかりませんが、何となく私も細胞が怪しいような気がします。 詳しい実験スケジュールが不明なので、何とも言えませんが、株化細胞なんかは結果が安定しにくいですよね。 既にコメントにあがっていますが、出来るだけ実験間の差が生まれないように考慮して実験をするようにしています。 ウェルなんかでの培養日数も私は統一するようにしています。

(無題) 削除/引用 No.2149-4 - 2013/07/01 (月) 10:28:46 - ~ 不安定であることを確認した実験間で違いがあるのは何でしょうか？ 細胞や試薬について、使用時ごとにそれまでの履歴が違うものと考えて、 違いの原因を探してみてはいかがでしょうか。 何回も実験している以上、製造日と製造からの経過日数、使用したロット等がすべて同じではないはずです。 考慮してもよさそうな条件 ・細胞自体の継代安定性(特に、血清入り培地から無血清に切り替えた時からの継代回数) ・サブコンフルエントの具体的な細胞密度 ・実験の1回前の播種密度や培養日数 ・無血清培地のロット間差 ・IL1βの安定性（濃縮液の状態で） ・IL1βの安定性（培地に添加された状態で） ・インキュベーターの温度や炭酸ガス濃度の均一性 上記の対応方法 ・起こしてからの継代回数や継代間の日数を揃えて実験する ・添加剤は濃縮液の形で小分けして冷凍保存し、使用直前に培地に添加する

(無題) 削除/引用 No.2149-3 - 2013/06/29 (土) 13:39:34 - とある研究者 コメントありがとうございます。細胞ですが、G26-24という株化細胞で、いつも同一のシードロットから起こし、サブコンフルエントで使っています。

(無題) 削除/引用 No.2149-2 - 2013/06/29 (土) 13:19:53 - おお 細胞の方を疑う余地はないですか?

サイトカインでの細胞刺激について 削除/引用 No.2149-1 - 2013/06/29 (土) 12:02:44 - とある研究者 アストロサイトの炎症性サイトカインによる刺激を行っているものです。IL1βを購入し無血清培地にて添加しあるタンパク質の遺伝子発現を時間を追って調べたりしていますが、やる度に出たり出なかったり。キャリアフリーのIL1βだったので凝集するのかと思い、BSAキャリアのものを入手し直して試しますが、1回目は上手く誘導がかかっても次回はだめ。一体どうやったら安定するでしょうか？どなたか同じような経験をお持ちで、解決に至った方、アドバイスをお願いします。安定な発現が見られるようになったら、その先に薬剤の効力評価をしますので、まだそんな段階でのつまづきに苛立っています。目的の遺伝子はすでにアストロサイトで誘導されることが報告されています。

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