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(無題) 削除/引用 No.2140-5 - 2013/06/29 (土) 14:03:30 - mon >[Re:3] 精製者さんは書きました : > 大腸菌を直接グアニジンに溶かしたのではなくて、 > 通常の超音波破砕もしくは市販の溶解液で大腸菌を破壊後、 > 遠心して沈殿したものをグアニジンに溶かしました。 ここだけ読むと、分散した不溶性細胞壁（の断片）がゆっくりと沈殿してしてきただけのような？ グアニジンに溶かして、すぐに高速遠心し同様な沈殿が得られるようなら、不溶性細胞壁（の断片）ではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2140-4 - 2013/06/28 (金) 16:15:08 - おお 尿素はせんたくしかと。あとは界面活性剤ですね。tritonなどで解けなければサルコシルなど。ただしNiカラムとは相性が悪いので高濃度はつかえません。0.2%ぐらいならいいようですが。 6Mグアニジン塩酸塩でも、溶解する溶液の量を増やせば沈殿はへるかもしれません。 まあ実際に6Mグアニジン塩酸塩で解けない事例を知っているわけではありませんが、そう言う状況で凝縮(っていえるかわかりませんが)みたいなのがおこるタンパク質があるといわれても別に不思議に思いません。

(無題) 削除/引用 No.2140-3 - 2013/06/27 (木) 22:24:57 - 精製者 コメントありがとうございます。 大腸菌を直接グアニジンに溶かしたのではなくて、 通常の超音波破砕もしくは市販の溶解液で大腸菌を破壊後、 遠心して沈殿したものをグアニジンに溶かしました。 これまで、数種のタンパク質の場合はきれいに溶けたのですが、 今回のタンパク質では、しばらくすると不可溶なものが出てきたのです。 そのことから、大腸菌の脂質などではないと思いますが・・・。

(無題) 削除/引用 No.2140-2 - 2013/06/27 (木) 20:56:57 - qq >しばらくすると不可溶性のものが出てきました。 大腸菌はタンパクだけでできているのではないので、不溶性のものもあるでしょう。 膜脂質や細胞壁はきっと溶けません。 もしかするとNi-columnのせいで還元剤を使えないかもしれませんが、還元剤を添加することが可能であれば、タンパクの変性と溶解性が増します。 何より、大腸菌の沈殿をGuHCl液で溶解した後、遠心（室温で12000rpmx20min程度？）して上清（可溶化抽出液）を使うのですが、そこは宜しいですか？ GuHClは確かに尿素より可溶化力が強いと思いますが、抽出液に可溶化されているのかをSDS-PAGEで調べるときに困るので、可能であれば尿素を使います。

6Mグアニジン塩酸塩に溶けないタンパク質 削除/引用 No.2140-1 - 2013/06/27 (木) 16:37:42 - 精製者 大腸菌からタンパク質を精製しようと考えています。 どうやらインクルージョンになりそうなタンパク質なのですが、 6Mグアニジン塩酸塩のバッファーに溶かしてみたところ、 いったんは溶けたように見えましたが、 しばらくすると不可溶性のものが出てきました。 これがタンパク質かどうかは確認中ですが、 6Mグアニジン塩酸塩に溶けないようなタンパク質ってあるのでしょうか？ 経験がある方、教えていただけけるとありがたいです。 その場合、どのようなバッファーで可溶化させればいいのでしょうか？

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