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(無題) 削除/引用 No.2138-6 - 2013/06/29 (土) 15:44:42 - mi1 バクテリアの場合、生物種によりRNA抽出のされやすさは千差万別で各生物種に合わせた方法を用いる必要があります。 試薬をかけただけではほとんど取れないこともあります。 他にもホットフェノール法など色々なメソッドがありますし、同じ生物を扱っている論文を探せば有効な方法が出ているかもしれません。 そのうえで、AGPC法試薬でOKであるはずの場合、 あなたのミスでロスした可能性、 その人のRNAの定量が過大評価である可能性 を考えて、それがないのであれば抽出法の問題ですから、 その人のやり方との差異を詰めて考えていけばいいのではないでしょうか。 RNAisoは他社の試薬と性状が少し違う気もするので他の試薬を試すのもよいでしょう。

(無題) 削除/引用 No.2138-5 - 2013/06/28 (金) 10:57:05 - AP RNAの精製を細菌でやったこともRNAisoでやったこともないのですが、 プラスミドを取るときにアルカリSDSで大腸菌は容易に溶菌しますから、AGPC法で溶菌しないはずないと思います。ホモジナイズってそんなに重要でしょうか。 ・AGPC法は多糖類の除去が得意でない。外膜由来のペプチドグリカン、LPSなどが干渉しているのではないか→前処理としてlysosome処理をしてみては。酵母では細胞壁を分解除去する前処理が推奨されていますね。 ・相分離したとき、中間層に不溶化した大量のゲノムDNAによってRNAがトラップされているのではないか→真核生物を材料にしたときにもありがちです。ゲノムDNAの粘性が無くなる程度までせん断化してみては（注射針に通すなど）。

(無題) 削除/引用 No.2138-4 - 2013/06/27 (木) 22:32:34 - soybean 直輝さん、ｐｊさん ご回答ありがとうございます。 試してみないとわかりませんね。 サンプル量を変えて、いろいろと検討してみます。 確かに根粒菌は酵母菌よりも細胞の大きさが小さいですが、 同じくRNaiso plusを使ってRNA抽出を行った事がある人に聞いたところ、 10＾7cellsの根粒菌から1μgは採れたそうです。 自分のサンプルはその10倍なのに、同じ量しか取れなかったため 方法に何か問題があったのかと考えました。 後は考えられる原因としては、細胞のホモジナイズ不足ですが…。 ガラスのホモジナイザーで破砕しただけでは不足なのでしょうか？ 重ねての質問ですみません。

(無題) 削除/引用 No.2138-3 - 2013/06/27 (木) 02:31:10 - 直輝 根粒菌は酵母よりもずっと小さいみたいだから、10^8 cells で問題なさそうに思います。単に細胞が小さいからRNAも少なかっただけじゃないかな。

(無題) 削除/引用 No.2138-2 - 2013/06/27 (木) 01:43:36 - pj 開始サンプルの上限量も、守らなかった場合の収量の低下も、サンプルによって大きく違いうるものですから、具体的な数値は同じ材料で実際にやってみないと分からないです。説明書の表に載っているのは一般的な材料についての目安の数値で、厳密に守らなければいけないというものではないです。 説明書を見てみましたが、載っているのは前処理試薬の使用が前提の酵母の場合の数値ですから、そのまま根粒菌にはあてはまらないかもしれません。収量自体も材料によって違うので、1 ugが失敗か妥当な量かもこれだけではわかりません。自分で適当な量を判断しなければいけないのですが、最初の実験で簡単にでも条件検討をされるとよいと思います。例えばですが、10^8　cellsのサンプルがあったら、それを1.1 mlの試薬で室温静置まで処理してから100 ulを別のチューブに取って、試薬を900 ul足して別のサンプルとして抽出をします。サンプル量とRNA収量が比例していれば10^8 cells は試薬の上限は越えていない、比例していなかったらその量では収量の低下があると判断できます。

RNA抽出の開始サンプル量について 削除/引用 No.2138-1 - 2013/06/27 (木) 00:09:37 - soybean 今日は。初めて質問させて頂きます。よろしくお願い致します。 先日、TAKARAのRNAiso plusを使って、根粒菌からRNAの抽出を行いました。 説明書には開始サンプル量はRNAiso 1mlにつき5*10^7cellsが上限とありましたが、菌体を保存していたチューブが1.5ml容量だったので、大丈夫かなと思いつつも10^8cellsで開始してしまいました。それ以外は説明書通りの操作を行いました。 （もう2度とこのような浅はかなことはしませんが…） 結果はというと、トータルで1μgしかRNAが回収できませんでした。 そこでお聞きしたいのですが、市販されているRNA抽出キットや試薬に書かれている開始サンプルの上限量はどれくらい厳密に守る必要があるのでしょうか？ また、それを守らなかった場合、それくらい収量が低下するのでしょうか？ 同じような経験がある方、RNA実験に詳しい方、ご回答をお願いします。

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