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質問者です。 削除/引用 No.2133-8 - 2013/06/27 (木) 16:23:55 - サーク う様、ご返答ありがとうございます。 教えていただいたことをヒントにして、上司と相談のうえ、考えてみたいと思います。 ご親切にありがとうございました。 とても勉強になりました。

(無題) 削除/引用 No.2133-7 - 2013/06/27 (木) 08:58:36 - う Srcにtagをつけることについては、目的によるので回答できません。 初学者ということですので、ここで私が言うことを鵜呑みにする前に 自分が行いたい実験と似たようなことを行っている論文 （必ずあります）を読んで勉強することをお勧めします。 その上で、簡単に 内在性と全く同じ制御を受けて浮ことが可能なSrcを念頭に置いた場合 タグをつけるのは駄目だと思います。 あと、N末やC末にタグをつけることについては、 既存の論文に、そこ部分をいじった変異体の解析が ごまんとあるでしょうから、 そこから、自分がタグを付けたことによって 何をしたことになるのか、考えましょう。 あと、パルミトイル化ですが、 Srcファミリーにはミリストイル化だけか その両方の就職を受けるものがあります。 それぞれ局在が異なることが言われています。 N末をいじるということは、パルミトイル化も阻害する ということです。 また、上司や担当教官にもちゃんと相談しましょう。

質問者です。 削除/引用 No.2133-6 - 2013/06/26 (水) 16:45:45 - サーク う様、ご返答ありがとうございます。 では、実際Srcファミリーキナーゼにタグを付けるのはあまり好ましくない、あるいは難しい、ということなのでしょうか？(もちろん状況によるとは思いますが…。) 現在、Srcファミリーキナーゼにできればタグを付けたいと考えているのですが、そのような発現ベクターを作製した際にどの程度実験に影響(悪影響？)があるのかわからず、決めかねている次第です。 パルミトイル化に関してはすみません、当方、初学者かつ勉強が足りず、今少し勉強しました。 このパルミトイル化は今回僕の疑問に関わってくるということなのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2133-5 - 2013/06/26 (水) 14:31:42 - う あと、パルミトイル化は知っていますよね？

(無題) 削除/引用 No.2133-4 - 2013/06/26 (水) 14:26:35 - う １について 活性が強い弱いとかを論じるのは意味が無いと思います。 きちんとした場所に局在しなくなるのですから、 機能そのものに違いがあると考えるべきかと。 Srcファミリーを取り扱った論文で、 mutant studyを行ったものは多いでしょうから、 その図を見ると、局在の違いと機能の違いについては 察するにあまりあるかと。 2について ＞(なぜかはわからないが)CskがSrcにアクセスできなくなるということでしょうか？ なぜかはわからないってことは無いと思いますけど、、、 酵素はタンパク質の立体構造を認識するのであって、 大きなタンパク質があれば、認識も難しいのは簡単に想像できるかと。 実際、これも論文のmutant studyを見れば その部分のリン酸化および活性化したときのリン酸化が 示してあると思います。 それらの結果から、cnstitutive activeであることがわかると思います。 ３について はい。これもmutant studyを行った論文は多数あると思います。

質問者です。 削除/引用 No.2133-3 - 2013/06/26 (水) 13:37:10 - サーク 質問者です。 う様、ご返答ありがとうございます。 ご回答を拝見して、いくつか追加で疑問点があります。ご返答頂けると幸いです。 �@N末端にタグを付けるとミリストイル化されずきちんとlocalizationしなくなるということは、細胞内でのSrcの活性としては弱まりそうですが、そうなのでしょうか？それとも過剰発現系ならば関係ないのでしょうか？ �AC末端にタグを付けるとC末端側がリン酸化されないというのは、Cskによるリン酸化部位がSrcのごく末端にあるので、(なぜかはわからないが)CskがSrcにアクセスできなくなるということでしょうか？ �B上記のことは他のSrcファミリーキナーゼ(Hck、Lyn、Fyn、Yes、Lckなど)でも基本的に同じと考えて差し支えないでしょうか？ ご多忙中大変恐縮ですが、ご教授願います。宜しくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.2133-2 - 2013/06/26 (水) 11:29:11 - う N末端にタグを付けるとミリストイル化されません。 そうなると、タンパク質として きちんとlocalizationしなくなりますので、 それはwild typeのSrcとは言えないです。 逆に、C末端にタグを付けると constitutiveな活性化型になりますので （C末端がリン酸化されないので） それもwild typeのものとは言えないと思います。 それを個人がどう考えるかですがね。 constitutive activeでもいいからSrc-GFPとかは 見かけたことがあります。 それは目的によると思われます。

Srcのタグ付けに関して 削除/引用 No.2133-1 - 2013/06/25 (火) 22:14:29 - サーク こんにちは。 勉強してもわからなかったもので、質問させていただきます。 ご存知の方がおられましたらご教授いただけると幸いです。 Srcなど、N末端がミリストイル化するタンパク質の発現ベクターを作成する際に、N末端にFlagなどのタグを付けることは可能なのでしょうか？ 実際にSrcのN末端にタグをつけたという文献はあるようなのですが、その発現ベクターを作製できる理論がどうにも理解できません。 ミリストイル化は最初のメチオニンが除去され露出した二番目のグリシンにミリスチン酸が結合する反応だと思うのですが、Flag-SrcなどのN末タグのSrc発現ベクターを細胞にトランスフェクションした際にはミリストイル化によってタグが飛んでしまうのではないでしょうか？ 調べてもどうしてもよい資料が見つからず困っております。よろしくお願いいたします。

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