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抗体が沈殿して困る トピック削除
No.2121-TOPIC - 2013/06/21 (金) 20:16:16 - 抗体沈殿
今、抗体に蛍光色素をＥＤＣ/ＮＨＳで固定化しています。濃度を振ったりしているのですが、どうしても透析をすると沈殿がでます

界面活性剤を入れるプロトコールを知らないのですが
tritonやtweenを入れて反応を行なったご経験あれば
教えていただきたいです
　
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ありがとうございます 削除/引用
No.2121-14 - 2013/07/01 (月) 22:57:22 - 抗体沈殿
いろいろとご意見ありがとうございます

抗体は市販のものを購入しており、精製度に関しては申し分ないです

沈殿しているものが抗体であるか確認したかどうかなのですが、色素は低分子ですので、急に溶解性が悪くなる（つまり透析を行っているので、反応液より濃度は低くなる）ことはないかと思っていますので、沈殿しているものは抗体ではないかと思っています。

色素はカルボキシル基しかなく、それ以外の反応性官能基はないです
（ベンゼン環がついていますが・・・）

なるほど、メルカプトは入れていないですね。還元剤ですので
抗体のＳ−Ｓ結合が切れるのでは？と思っていますので

arigatou 削除/引用
No.2121-13 - 2013/07/01 (月) 22:52:26 - 抗体沈殿

(無題) 削除/引用
No.2121-12 - 2013/07/01 (月) 15:30:21 - qq
大まかにThermoの取説だと、（http://www.funakoshi.co.jp/data/datasheet/PCC/22980.pdf）
１）　R1-COOH + EDC + NHS ==>　R1-COO-NHS
２）　beta-mercaptoethanolでquenching
３）　R1-COO-NHS + R2-NH2 ==> R1-CO-NH-R2
こんな感じなんですが、b-mercaptoethanolでquenchingって、私は知りませんでした（
お勉強になるなあ。）
quenchingできていないと、後で添加するIgGがEDC+NHSで重合するのだけど、そこは大丈夫でしょうか？
沈殿するのは、IgGが重合しているからではないでしょうか？
そうであれば、EDCのquenchingに注意すると良いかもしれません。

(無題) 削除/引用
No.2121-11 - 2013/07/01 (月) 13:51:30 - ｃDNA
アドバイスでなくて申し訳ないのですが、疑問に思ったこととして、

１）その抗体は精製したものか、血清か、など、純度はどの程度でしょうか。

２）また、沈殿しているものが抗体であることを確認したのでしょうか。

３）蛍光物質はカルボン酸以外に水溶性に寄与するような官能基がありますか。

蛍光強度がどの程度必要かに依りますが、もしアミノ基をマスクし過ぎて溶解性が落ちているなら修飾の程度を下げるといいように思います。しかしそれだと透析する前から沈殿が始まりそうな気もします。

透析の時の溶液や、そもそも何を除きたいのかも重要かもしれないですね。反応試薬を除きたいなら簡単なカラムでも良さそうです。

なるほど 削除/引用
No.2121-10 - 2013/07/01 (月) 12:47:14 - 抗体沈殿
みなさん
いろいろとご意見ありがとうございます

今は、市販でマイナーな蛍光分子を抗体にくっつけようとしているので
他のメジャーな色素やＦＩＴＣのようにアミノ基に反応のある官能基がくっついた試薬は購入できないです

ご指摘のとおりＥＤＣ/NHS系では、抗体自身および抗体間でも反応が起こり凝集が起こると思い、濃度を半分でやってみたのですが、それでも沈殿が生じてしまいます
しかし、同じＥＤＣ/NHS濃度で蛍光分子の濃度が低い場合、沈殿は生じないので、どうもEDC/NHSの濃度は問題ないのでは？と思っております

(無題) 削除/引用
No.2121-9 - 2013/06/29 (土) 16:37:58 - mon
なでしこ組様、ありがとうございます。
そのような解釈は思ったことも無く、勉強になりました。

(無題) 削除/引用
No.2121-8 - 2013/06/28 (金) 14:33:30 - なでしこ組
トピ主の話からは逸れるが、
Nuncは自分とこの求電子性の光架橋基が求核性がある水酸基とも
反応することを懸念しているようだけど、怪しいもんだな。
禁忌される本当の原因は、この材料へのリガンドのカップリング
は固ー液反応な訳だから、界面活性剤の存在下では界面活性剤が
ポリスチレンプレートに優先的に吸着することで、反応基を立体
障害的にマスクしてしまうっていうところだろう。
まあ、理由はどうあれTween 20が禁忌物質であるってことには
変わりはないにしてもね。

(無題) 削除/引用
No.2121-7 - 2013/06/23 (日) 09:42:44 - mon
Nunc Immobilizer AMINO plateマニュアルに、"a stable electro- philic group that reacts with nucleophiles such as free amines, thiols or hydroxy-groups"と記載されていましたので、この官能基(EDC/NHSではない）は非イオン性界面活性剤の水酸基とも反応するようです。
これが架橋時に共存しては行けない理由ですね。
従いまして
「tritonは不明ですが、tween20は求核反応の標的になりますのでアミノ基を標的とする架橋剤には使用不可です。反応後に添加するのは未反応分子のクエンチングになるでしょう。」
の一文は「誤り」です。
ご指摘ありがとうございました。謹んで訂正させていただきます。

(無題) 削除/引用
No.2121-6 - 2013/06/23 (日) 09:35:25 - mon
qq様、tdk様「tween20は求核反応の標的になりますので」は私の誤読・記憶間違いかもしれません。該当文書を何処かに保存した気がするのですが、探しだせません。もし見つかれば報告します。
なお、官能基が異なるのですが、Nunc Immobilizer AMINO plateマニュアルには、架橋時Tween20等の非イオン性界面活性剤を使うなと記載があります。ただし、架橋後に使うことはは、むしろ推奨されています。

(無題) 削除/引用
No.2121-5 - 2013/06/22 (土) 19:38:19 - おお
透析の時に沈殿が出るのなら、架橋ざいを中和するときか、透析の時に界面活性剤をいれればいいんじゃないかなぁ。tweenよりtritonの方が長期的な視野で考えると安定だと思います。

(無題) 削除/引用
No.2121-4 - 2013/06/22 (土) 16:20:28 - tdk
本題ではないですが、同じくTween20がアミノ基を標的とする架橋の妨害をするというのは私も？？です。qqさんの書かれたように、この構造で攻撃されますかねえ？？

ところで、本題のご質問ですが、抗体の蛍光標識が目的なら、NHSエステルが結合した蛍光色素が売られてるので普通はそちらを使うと思いますが、新規合成試薬ですか？EDC/NHSを使った架橋だと、量比に気をつけないと、抗体自体も架橋されて沈殿するような気がします。

(無題) 削除/引用
No.2121-3 - 2013/06/22 (土) 15:54:02 - qq
>tween20は求核反応の標的になりますのでアミノ基を標的とする架橋剤には使用不可です。

tween20って、POLYOXYETHYLENE SORBITAN MONOLAURATE　　(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/summary/summary.cgi?cid=443314&loc=ec_rcs)
のTween20ですよねぇ。求核反応の標的になるのが想像できませんが、そうなのかなぁ？

(無題) 削除/引用
No.2121-2 - 2013/06/22 (土) 15:40:59 - mon
tritonは不明ですが、tween20は求核反応の標的になりますのでアミノ基を標的とする架橋剤には使用不可です。反応後に添加するのは未反応分子のクエンチングになるでしょう。
高濃度かつ4℃で保存すると沈殿しやすい、とあるmAbは、0.1M HEPES(pH7-8)や0.1M Na-PO4(pH7-8)で保存していました。反応には使えませんがTrisも沈殿抑制効果（0.2M以上？）があるようです。ご参考になれば。

抗体が沈殿して困る 削除/引用
No.2121-1 - 2013/06/21 (金) 20:16:16 - 抗体沈殿
今、抗体に蛍光色素をＥＤＣ/ＮＨＳで固定化しています。濃度を振ったりしているのですが、どうしても透析をすると沈殿がでます

界面活性剤を入れるプロトコールを知らないのですが
tritonやtweenを入れて反応を行なったご経験あれば
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