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(無題) 削除/引用 No.2099-14 - 2013/06/17 (月) 21:19:45 - gDNA AP様 実はPEG沈はやったことがないので、 試してみます。ご回答ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.2099-13 - 2013/06/17 (月) 21:13:43 - AP >中年様の言うとおり、酢酸アンモニウムでは除けないので、 >直輝様の言うようにビーズかカラムで精製する必要がある、 >というわけですね。納得です。 プラスミド精製でやるように、PEG/NaCl沈殿でいいんじゃないか？ 20% PEG800/2.5M NaClを3/5 vol加えて遠心。

(無題) 削除/引用 No.2099-12 - 2013/06/17 (月) 19:37:00 - gDNA 直輝様、おお様、中年様 みなさまありがとうございました。 RNaseAとT1が入ったRNaseカクテルを使っていますが、 それでも確かにリボヌクレオチドにはなりませんね。 中年様の言うとおり、酢酸アンモニウムでは除けないので、 直輝様の言うようにビーズかカラムで精製する必要がある、 というわけですね。納得です。 ところで、このようなRNAのオリゴを除くのに、 MicroSpin S-400などを使ったゲルろ過は有効でしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2099-11 - 2013/06/16 (日) 00:25:13 - 中年 RNaseとして何をお使いかわかりませんが、RNase Aならば分解産物はリボヌクレオチドではなくて短鎖RNAです。酢酸アンモニウムを用いたエタノール沈殿では除けないと思います。

(無題) 削除/引用 No.2099-10 - 2013/06/15 (土) 15:27:31 - おお まだ何か不純物があるので部分的にうまく解けない部分があるのかもしれませんね。OD比はめやすですから、それだけではなんともいえませんし。 ローディングバッファーにSDSが入っているようなものもあるぐらいですから、えいどうするサンプルに0.1%SDSを加えてしばらく40度ぐらいで温めると違うかもしれませんが、、、 何が目的かわからないので、解決策になっているかどうかすらわかりません。 DNA量の見積もりの矛盾はわたしもRNAだとおもいます。短いRNAでもエタチんで挙動をDNAとともにすると思いますので。エチブロは一本鎖の核酸にたいしては検出感度が高くありませんのでそこそこの量あっても検出されませんでしょうし。

(無題) 削除/引用 No.2099-9 - 2013/06/15 (土) 10:52:51 - 直輝 >RNaseで処理して、電気泳動的にはRNAがないのですが、分解物をナノドロップは拾っていると考えていいのでしょうか。 そうです。分解しても260nmの吸収はなくなりませんから。 エタ沈で短い核酸はかなり減るはずだけど、それだけ差が大きいのはRNAのせいだと思う。 ただし、電気泳動がスメアになる場合はDNAの分解も考えないといけない。 酢酸アンモニウムを使ったエタ沈は経験がないので分かりません。 私はGeneCleanとかガラスビーズのキットでRNAを除いてます。

(無題) 削除/引用 No.2099-8 - 2013/06/15 (土) 05:34:34 - gDNA 直輝様 RNaseで処理して、電気泳動的にはRNAがないのですが、分解物をナノドロップは拾っていると考えていいのでしょうか。 RNase後はフェノクロと酢酸ナトリウムのエタ沈ですが、塩を酢酸アンモニウムにすることで、リボヌクレオチドを除けばPicoGreenの値とナノドロップの値が近づくでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2099-7 - 2013/06/15 (土) 05:30:56 - gDNA AP様 gDNAは、しっかりと溶解していると思います。これを確かめるのは難しいのですが、gDNA溶解液を1/10に薄めたものを電気泳動すると、ウエルで光るものの量も1/10程度になります。 また、DNA溶液に粘性はありません。これを考えると、ものすごい高分子があるわけでもなさそうですね。

(無題) 削除/引用 No.2099-6 - 2013/06/14 (金) 22:29:21 - 直輝 >ナノドロップでのA260/280,A260/230の値は2.0程度ととても良好で、収量もよいのですが、Picogreenで計測するとナノドロップの収量の1/10程度の量になってしまいます。 PicogreenがゲノムDNAの収量で、ナノドロップとの差（つまり9/10）はRNAでしょうね。

(無題) 削除/引用 No.2099-5 - 2013/06/14 (金) 21:07:29 - AP >不純物にgDNAが絡まって >光っているのかもと考えたりしているわけです。 私の回答は、そうではないと申し上げている。で、それはかなり核心をついているだろうと信じています。 gDNA自体が適正に懸濁、溶解されていないとそうなりますよと言うのは、御理解いただけていますか。

(無題) 削除/引用 No.2099-4 - 2013/06/14 (金) 19:52:34 - ｇDNA AP様、~様 ご回答ありがとうございました。 ナノドロップでのA260/280,A260/230の値は 2.0程度ととても良好で、収量もよいのですが、 Picogreenで計測するとナノドロップの収量の 1/10程度の量になってしまいます。 その原因は不純物がナノドロップの値を かさあげしているとのことですが、 一方でinvitrogenによるとintactなgDNAでは色素が入りにくく、 過小評価されてしまうことがあるとも。 で、ウエルから動かないEtBrで光る存在はgDNAでは？ とおもった次第です。 ~様がおっしゃる様に、制限酵素で消化すると なくなるのですが、ウエルから23kbの間に スメアが増えるわけではなく、23kbから下にスメアが 観察されるだけなので、不純物にgDNAが絡まって 光っているのかもと考えたりしているわけです。

(無題) 削除/引用 No.2099-3 - 2013/06/14 (金) 16:38:10 - ~ gDNAが書かれている位置に来ることはありますが、 それは今見えているものが不純物でないことは示しません。 適当な制限酵素で切った後に泳動することにより、 高分子であれば切断されて低分子のスメアとなり、 不純物であれば同じ位置に残ることで確認ができるでしょう。 （見えているものは高分子gDNAであっても、とても汚くて制限酵素で切れない場合は、後者と誤認してしまいますが）

(無題) 削除/引用 No.2099-2 - 2013/06/14 (金) 13:03:49 - AP 精製されたゲノムDNAはせん断されているので、まあそれくらいのサイズ(23 kbマーカーと同程度のところ）に見えておかしくないです。0.8％agarose gelだと23 kbだろうと100 kbだろうとほとんど同じところに見えるでしょう。 どの程度せん断されるかは、方法によります。ゲノムライブラリーを作るときのようにせん断を極力避けたいときは、核を壊さないようにホモジナイズして核を分画し、穏やかに核膜を溶解してから、剪断力がかからないように最新の注意をはらってDNAを精製します。 ふつうやるように、核膜を壊しながらホモジナイズして精製したら100 kb前後にせん断されてるんじゃないでしょうか。さらにカラム法だと原理的にかなり細かくせん断されたDNAしかとれません。 さて、 >さらに、しばしばウエル下端もEtBrで染まり、ウエルから23kbまでの間も 薄ーくスメアが見られることがあります（23kb以下にはスメアなし）。 一旦EtOH pptをしたDNAで、均質によく溶けていないのではないでしょうか。あるいは濃く溶かしすぎてDNA溶液がかなりの粘性を持っているんじゃないでしょうか。十分溶けきっていなかったり粘性が高すぎたりするDNA溶液はすんなりゲルマトリックスを通っていかないので、そのような像になります。 濃度薄めに溶解または希釈して泳動したらいいと思います。

gDNAのアガロースゲル電気泳動 削除/引用 No.2099-1 - 2013/06/14 (金) 11:42:21 - gDNA 皆様、お世話になります。 gDNAの0.8%アガロースゲル電気泳動についてお聞きしたいのですが、 0.8%ゲルで電気泳動するとλ/HindIII size markerと比較すると、 gDNAは23kb程度のところにバンドが観察されます。 さらに、しばしばウエル下端もEtBrで染まり、ウエルから23kbまでの間も 薄ーくスメアが見られることがあります（23kb以下にはスメアなし）。 このようなウエルから動かず、EtBrに染まるものは長いgDNAでしょうか？ それとも不純物と考えた方が良いのでしょうか？ 過去トピで検索しましたが、もれがありましたらご容赦ください。

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