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(無題) 削除/引用 No.2090-5 - 2013/06/13 (木) 12:51:38 - kk 少なくともKODはligationの反応温度では活性がないので失活させる必要はないようです。 そのままligationまでやる場合は、バッファーの組成に注意が必要です。 そう意味では、グアニジン塩やフェノールでなくても、エタ沈でバッファー交換できれば十分な気がします。 ちなみに、いつもはスピンカラムで精製・脱塩してますが、あまり経済的ではないですね。

(無題) 削除/引用 No.2090-4 - 2013/06/13 (木) 11:22:36 - ttt Pfu polymeraseを使って平滑化してますが、ポリメラーゼを失活するのを期待してエタ沈してますが、その後のプロセスも問題ないので多分効いてるのだと思います。

(無題) 削除/引用 No.2090-3 - 2013/06/12 (水) 14:02:43 - i >> kkさん ありがとうございます。 やはりTdT活性がないProof Reading酵素であれば問題ないのですね。 Hotstartのものなので、抗体の失活は必須という事は承知しています。 確かにコストパフォーマンスは悪いですが、滅多に使用する事がないので 代用出来ればと思った次第です。 すみません、追加質問です。 グアニジン塩酸塩によるポリメラーゼの失活は可能でしょうか。 フェノールで失活させるのが古くから安全策かと思いますが、 フェノール等を扱わせたくない時もあります。もし可能であれば 代用できるかなと思った次第です。

(無題) 削除/引用 No.2090-2 - 2013/06/12 (水) 13:56:15 - kk TdT活性がない酵素なら普通にできますよ。 TOYOBOの平滑化キットの中身はKODですし。 High-Fiedilityな酵素ならコストパフォーマンスが悪かったり、抗体が入ってる酵素なら一度抗体を失活しないといけなかったり注意しないといけませんが。

Vectorの平滑化について 削除/引用 No.2090-1 - 2013/06/12 (水) 13:40:05 - i お世話になります。 通常、Vectorの平滑化にはKlenowやT4 polを用いると思います。 しかし中にはpfuやKOD系を利用しているプロトコールも見かけます。 これらで突出を削る、または埋めた事がある方の感想を是非お聞きしたいです。 もし問題ないのであれば、Q5等の酵素でこれから代用しようと思います。 試薬が増えると管理が大変なので…。

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