全7件 ( 1 〜 7 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.2089-7 - 2013/06/12 (水) 16:42:14 - ~ 解析した8クローンと、問題になっているクローンの関係がよくわかりませんが。 3'RACEということは、既知の配列をプライマーにして増やしたら、 下流が期待外れの配列だったということですよね。 期待と異なるフラグメントの増幅が起きる条件だったのではないでしょうか。 キットの説明書ではPCRの条件検討が必要のように書かれていますが、それは既に行っているのでしょうか？ ゲノム情報がある生物であれば、どこが増えていて、 プライマーとどのくらい相同性がある部分にアニールしていたのかを確認されてはいかがでしょうか。 プライマーがそこにアニールしてしまう限り、その配列は今後も増幅され続けるでしょう。 PCRの条件が甘くて相同性が低いのにアニールしている→PCRをきつめの条件にする 使用したプライマーだと、目的外の配列と一致してしまう→プライマー配列を変える 期待したサイズよりだいぶ小さい長さだった→電気泳動で期待するサイズのあたりを切り出す

(無題) 削除/引用 No.2089-6 - 2013/06/12 (水) 16:36:47 - ｃDNA 勝手に要約すると、 「あるタイプのシグナル配列を釣り上げる方法で、シグナル配列を含む配列を8個の配列を得たけど、その中に目的の特定の配列を含むものは無かった」ということでしょうか？ そうだとして、 >このような問題を生じる原因として何が考えられるでしょうか？ ということですが、何か問題が起きていますか？ 実験結果は書かれていますが(私の理解が正しくないかもしれないけど)、実験の前提、予想が書かれていないので、いろいろと想像でしか答えられません。8個拾えば欲しいものが入っている確率がどれぐらいだったのでしょうか？ 2個に1個は目的物である予定なら、8個も読めば見つかるのが普通でしょう。 100個に1個ぐらいの予定なら、8個じゃ足りないのは不思議ではないですよね。 改善方法としては釣り上げるときの選択性をあげるとか、より多くのクローンを大腸菌のまま目的配列があるかどうかを調べる手法を採用するとか。今回の目的配列でそのようなことが出来るかどうかは分かりませんけど。

(無題) 削除/引用 No.2089-5 - 2013/06/12 (水) 16:07:36 - おお ん、はずれをひろったっていうことなのかな?

(無題) 削除/引用 No.2089-4 - 2013/06/12 (水) 09:50:48 - mon 要約すると。「特定のシグナル配列をもつ遺伝子を釣り上げるため」実験したけど、「特定のシグナル配列」は観られなかった....ということですか？ 目的が今一不明ですが、手段に問題はないのでしょうか？？ 例えば、どのように「釣り上げた」のでしょうか？　特定シグナル配列を使った5'RACE?、それとも「特定のシグナル配列を有する特定な遺伝子の配列を使った5'RACEでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2089-3 - 2013/06/12 (水) 05:10:18 - おお >[Re:1] となりは山田くんさんは書きました : > 1つは得られた塩基配列に「既知の特定のシグナル配列をもつものがなかった」という点、 じゃあないということですよね。なぜその結果を受け止めないのか、、、 補足に >"解析によって明らかになった塩基配列には全てシグナル配列、3'adaptor配列が含まれていました" とかいてますが、じゃああったの? もう一点は「得られた塩基配列は、アミノ酸配列にすると複数終止コドンが入り正常に翻訳がされていると考え難い配列である」と点です。 上流から読まれるフレームでストップが入っていればタンパクの翻訳はそこでおわりです。幾らか例外があります(Selenocysteineなど)けど。お考えになっているシグナル配列がアミノ酸配列なら、それがないと言う事なので、それ以上なにを望まれているでしょうか。 > > このような問題を生じる原因として何が考えられるでしょうか？また、改善するためには何をすればよいでしょうか？ご教授お願い申し上げます。 > > 原因は分かりません。まずはゲノムの情報があるなら、その配列をもった、GSPから伸ばせるRNAはぞんざいするのかどうかは吟味できるでしょう。または得られた配列を用いたプライマーとあなたがつかったGSPより上流の配列などからのプライマーでRTPCRをかけてそのRNAが存在するか確認することはできるとおもいます。 となりの山田くんはなんていってますか?

(無題) 削除/引用 No.2089-2 - 2013/06/12 (水) 03:50:27 - 独り言 > 1つは得られた塩基配列に「既知の特定のシグナル配列をもつものがなかった」という点、もう一点は「得られた塩基配列は、アミノ酸配列にすると複数終止コドンが入り正常に翻訳がされていると考え難い配列である」と点です。 うーん。その特定のシグナル配列がなにかわからないので、なぜそもそもそのシグナル配列が入っていないことが問題となるのかわからんわぁ。それは絶対にあるべき配列ってこと？なのになかったということ？ 2点目の複数の終止コドンがあったとこのこですが、最初の終止コドンで止まればよいだけで、なぜその後の終止コドンが問題となるのかもわからんわぁ。それともリーディングフレームの中に終止コドンが入ってしまっているってこと？ 何が問題なのかもっと説明してもらえないと、わからんでござる。

3'raceを用いた遺伝子解析 削除/引用 No.2089-1 - 2013/06/12 (水) 01:40:59 - となりは山田くん 現在、卒業研究一環でmRNAの5'末端に特定のシグナル配列をもつ遺伝子を釣り上げるため、3'race(Takaraの3'-Full RACE Core Set)を行い、 pSTBlue-1を用いてクローニングを行い、塩基配列の解析を行いました。 その結果を見たところ、2点問題が生じました。 1つは得られた塩基配列に「既知の特定のシグナル配列をもつものがなかった」という点、もう一点は「得られた塩基配列は、アミノ酸配列にすると複数終止コドンが入り正常に翻訳がされていると考え難い配列である」と点です。 このような問題を生じる原因として何が考えられるでしょうか？また、改善するためには何をすればよいでしょうか？ご教授お願い申し上げます。 <補足> 用いたRNAはDNase処理を行ったためDNAが含まれないと思います。 解析に用いたサンプル数は8つで、いずれもブルーホワイトセレクションやコロニーPCRで遺伝子の導入は確認しています。 解析によって明らかになった塩基配列には全てシグナル配列、3'adaptor配列が含まれていました。

全7件 ( 1 〜 7 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---