BioTechnicalフォーラム [アガロース泳動の切り出し後のDNA精製について]

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(無題)

No.2078-8 - 2013/06/09 (日) 17:18:03 - ｃDNA

質問から、実際にどのような実験をしているか、分からない所があるので問題を絞りにくいです。

制限酵素で切って電気泳動を行っているのはインサート、ベクターの両方ですか？インサートだけですか？電気泳動が必要なほど、分けないといけない何かがあるのでしょうか？
目的物以外には小さい断片しか出ない場合は電気泳動を行わず同じキットでクリーンアップだけした方がDNAの収率は格段に上がります。

それぞれのサイズはどのぐらいでしょうか？
サイズが大きい場合には温めた溶出バッファーを使うことが推奨されていると思います。

制限酵素は一種類ですか、二種類ですか？
インサートをPCRで増やしているようですが、制限酵素で切れるのが数塩基しかない場合、切れたかどうかを調べる方法はないので、double digestionの場合に、実は片方が切れていなかったということもあります。

そもそもPCR産物だったら、まずクリーンアップしてから制限酵素処理して電気泳動してるのですか？分けたいものとの関連がありますが、PCRの副生成物を除きたいのであればまず電気泳動で分離してキットで精製してから制限酵素処理してクリーンアップ、の順番にすると、電気泳動に持って行けるサンプル量を増やしやすいと思います。

> ODのカーブが綺麗ではなく（OD280やOD260が低い）、収量も低すぎてうまくいきません。

ということですが、濃度の計算値はいくらですか？OD260がある程度以下であればナノドロップではカーブは線ががたがたします。単に装置の精度の問題です。カーブが綺麗ではない、というのは具体的に線ががたがた以外の意味でないとしたらそれは濃度が低いという事です。濃度が低ければ計算値と実際の濃度がかなり違うことも良くあります。
ですので、皆さんが濃度を電気泳動で確認してください、と説明されている訳です。

心配されているように電気泳動後のキット精製の収率が悪いだけでしたらそこまでのサンプル量を増やすのが確実性が高いと思います。現状では、どれぐらいの量を電気泳動で流して精製後のDNA量から収率はどれぐらいなのでしょうか？

(無題)

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No.2078-7 - 2013/06/09 (日) 15:45:22 - おお

既にしてきがありますが、10ng以上えいどうにもっていけるなら、電気えいどうで目的のものがあるかかくにんしてください。

数ナノがえちぶろの検出限界です。

(無題)

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No.2078-6 - 2013/06/09 (日) 14:46:26 - おお

収量が低ければ精製度も悪くなりますが、非常に短いやつだともしかしたらカラムにつきにくいということかもしれませんね。

1ngもあれば、いいコンぴテントを使っていればコロニーがえられるでしょう。短いものであれば質量が少なくてもコピー数はおおいでしょうし。

スピンカラムいがいの代替え商品はしりません。きれいになりませんがlow meltingでとかしてフェノール(クロロフォルムぬき)でなんかいかせいせいして、クロロフォルム、エタチンといった方法もありますが、、、収量はどうかなぁ。。。50%は取れると思うけど。。。最初の量にもよるかもしれません。

あ、そういえばV-chambersをつかったelectroelutionっていうのがあったなぁ。あんまりやっているひと、いなさそうだけど(わたしもやったことはないです)。

http://www.jove.com/video/2136/electroeluting-dna-fragments

V-chambersなしでelectroelutionするなら透析まくにげるをいれて、電気えいどうそうにいれて、でんきをながすと、まくのなかのばっふぁーに抜けて出てくるのでそれをえたチンするというのもあるけど。いがいと収量良くないこれが、、、

あ、それからDEAEのフィルターペーパーを電気えいどう中のとるサンプルのちょっと+がわでゲルに差し込んでエイどうしながらとらっぷしてフィルターペーパーからDNAを取るというのもありますね、、、これもやったことはありません。。。

TBEでながしているならTAEにするというのも気休め程度でできることかもしれません。昔のNaIをつかったグラスミルクでとるほうほうはTBEでは収量が落ちるということがあるようで、いまのスピンカラムも原理的にはほぼ同じですから。最近のスピンからむはいちおうTBEでも大丈夫といううたい文句はあるのでその当時より改善されているのだと思いますけど。

PCRならテンプレートが豊富なら反応溶液をふやすか、反応チューブをふやせば収量は稼げるでしょうし、プラスミドも多めに使うことはふやせばできると思いますが、、、それでも収量(最終的に得られる量)が変わらないならちょっと真剣に考えた方がいいかもしれませんけど、、、

(無題)

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No.2078-5 - 2013/06/09 (日) 14:20:24 - 直輝

そういう用途なら、制限酵素切断したPCR産物の精製後の濃度は0.01～0.02ug/uLぐらいかなと思います。私がやってもODのカーブは綺麗でないし問題ないです。

ライゲーションに問題があるか、制限酵素で完全切断できてないかじゃないかなと思った。

(無題)

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No.2078-4 - 2013/06/09 (日) 14:15:34 - Pumpkin

モモさんのいうように、キアゲンのカラムを通しても、
トピ主さんが思うような（？）
綺麗なカーブは得られないことが多いですね。
DNAの絶対量が少ないこともあげられるし、
wash bufferの残りの影響もあります。

溶出液をエタ沈しなおすと多少改善することがあります。
でも、収量は10ng/uLとかでもクローニング自体は問題ないですよね？

それよりもDNA量を増やそうとして、溶出液の持ち込み量が
多すぎるということはありませんか？

(無題)

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No.2078-3 - 2013/06/09 (日) 11:19:38 - モモ

キアゲンのキットを使ってますが、ゲル精製した産物はODのカーブはきれいにならないように思います。なので、クローニングができないことと、この部分は切り離して考えてよいと思います。

(無題)

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No.2078-2 - 2013/06/09 (日) 11:02:08 - TK-1

> ところが、ODのカーブが綺麗ではなく（OD280やOD260が低い）、収量も低すぎてうまくいきません。
ナノドロップで測れる濃度はあるんですか？

>
> PCR産物の確認泳動や、制限酵素切断産物の泳動では綺麗な目的サイズのバンドが得られるので、精製よりも前の段階では問題が無いだろうと考えています。
精製したあとのものを流してみてください。
それくらいの量でeluteしたのか知りませんが、どうせ全量使う訳でもないんですから、３分の１くらいをアガロースゲルに流して、ちゃんとバンドが取れているか見てください。サイズマーカーと照らし合わせるとだいたいの濃度もわかります。

>またコンピセルに入れて、コロニーを得る段階では、ポジティブコントロールの未切断ベクターからは沢山のコロニーを得られますので、精製よりも後の段階にも問題が無いだろうと考えています（精製かライゲーションかに問題がありそうです）。
未切断プラスミドと、同量のplasmidをつかったligation産物を比較してもね、それは全然違うもんです。ちなみに、どれくらいの量の未切断ベクターから何個のコロニーが得られたんですか？

アガロース泳動の切り出し後のDNA精製について

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No.2078-1 - 2013/06/09 (日) 10:52:20 - ぽにょ

よろしく御願いします。

キアゲンやタカラのスピンカラムを購入して、制限酵素切断したPCR産物の精製の目的のために、アガロース泳動をして、切り出しの後に、精製するために使ってみました。ライゲーションして、コンピセルに入れ、青白コロニーをえるのが目的です。

ところが、ODのカーブが綺麗ではなく（OD280やOD260が低い）、収量も低すぎてうまくいきません。

PCR産物の確認泳動や、制限酵素切断産物の泳動では綺麗な目的サイズのバンドが得られるので、精製よりも前の段階では問題が無いだろうと考えています。またコンピセルに入れて、コロニーを得る段階では、ポジティブコントロールの未切断ベクターからは沢山のコロニーを得られますので、精製よりも後の段階にも問題が無いだろうと考えています（精製かライゲーションかに問題がありそうです）。

スピンカラム精製では、もちろんプロトコル通りにしていますし、カラムにのせるサンプルが酸性であることも色で確認しています。

既出のFAQに近い質問かと思いますが、前スレに書いてあることをできるだけ守っているつもりなのですが、うまくいかず困っています。

何かアドバイスを御願いします。

またスピンカラム以外の何か初心者にも扱い安い、良い精製方法があれば教えてください。スピンカラムよりも多少、割高でもかまいません。

アドバイスをどうぞよろしく御願いします。

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