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(無題) 削除/引用 No.2078-49 - 2013/06/12 (水) 22:06:04 - ぽにょ 皆様、誠にありがとうございました。頂戴した情報を参考にして、再トライしてみます。

(無題) 削除/引用 No.2078-48 - 2013/06/12 (水) 16:04:55 - おお PAPにかんしては使ったことがないのでわかりませんが、CIAPなどは好みによって制限酵素処理と同時にやる人もいます。ただし私はあまり好きじゃなくえたちんかカラムのpurificationキットをつかうとか、なんらかの形であるふぉす処理をするようにしていました。そう考えるとやはり好みなどの部分もあるのかと思います。60度という温度でならたいていの制限酵素はへたってしまうでしょうから、制限酵素処理後、容量を5倍ぐらいに増やした状態でアルふぉすに持っていくというのも一つの手かもしれません。そうするとグリセロールでなやまないでいいかとおもいます。 ユニットの測定はたしかに名前とおりあるかりで活性があるタンパク質なのでアルカリ側のしてき濃度で測っているでしょうけど、提供されたバッファーなどの環境、プロとコールがだめという根拠になりませんよね。 よくバッファーの組成など注意深く見ているのでそれはいいことだとおもいます。で最後にアドバイスするなら、簡略かされたプロとコールで不都合があるかもしれないと気になるときは、基本に忠実に(こんかいのばあいだと、酵素処理後えたちんなどでバッファーを除いて、次の酵素にいい条件で(商品の勧める方法で)まずやって、同時に簡略化した方法をとりながらあなたの手ではここは簡略化しても大丈夫だとか感触をつかんでいくようにすればいいかと思います。 ま、てを動かしながら確認していけばどうでしょうか。 くわえて、かくすてっぷ、懸案事項を確認するポジこんがとれるか、ねがこんがとれるかも考えながら、やっていけばいいかと思います。よくここでも、コンストラクションしてポジこんはうんぬんとかいうはなしがでますが、一言にぽじこんねがこんといっても、らいげーす、あるふぉす、こんぴてんとせる、あらゆるしやくがありますから、一言でぽじこん/ねがこんですまないのでよくかんがえてみてください。 必ずとれということでなく、疑うステップでなにか確認する方法をもてるか、確認が必要と思うときにどういう方法がとれるかということです。

(無題) 削除/引用 No.2078-47 - 2013/06/12 (水) 10:23:45 - saba これまで何もしてなくてこんなこと言うのもホントは恥ずかしいんだけど、 ここで懇切丁寧に相手してくれてる方々は↓こんなこと分かりきっていて、 その上であなたの投稿の細かいところまでわざわざ目を通してくれてオッケって言ってくれてるの。 とりあえず一個だけでもコンストラクトがとれりゃいいっていう類だっていうこともあるし、とにかく今の環境で必要最小限のプロトコールを一通りきちんとやんなさいよ。 どういう問題が起こりやすくて、許容範囲がどのくらいなのか、、、まずは、それぞれの過程にどういう意味があるかわかってて、説明書読んであって、一つ一つの実験がきちんとできていることが前提でしょ。その練習をしなよ。 アルフォス以外は大した問題じゃなかった可能性大だし、しかしそれと同じくらいの大チョンボしてる可能性も同時に考えられるし。確かに操作は少ない方がいいけれど、エタ沈くらいちょいちょいと自信もってやれなくてどーすんのさ。

(無題) 削除/引用 No.2078-46 - 2013/06/12 (水) 07:23:58 - ぽにょ （連続で文字化けしてしまいました。おまけになぜか削除できません） それからPAPに添付の、希釈バッファや10倍反応バッファは、Tris-HClやglycineやTritonX-100の他に、ZnCl2、MgCl2、NiCl2を含みます。 本当には、制限酵素処理用のバッファの中ではどのくらい働けるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2078-45 - 2013/06/12 (水) 07:19:45 - ､ﾝ､ﾋ､� ､ｽ､�､ｫ､餘AP､ﾋﾌ�ｸｶ､ﾎ｡｢ﾏ｣瘠･ﾐ･ﾃ･ﾕ･｡､�10ｱｶｷｴ場･ﾐ･ﾃ･ﾕ･｡､ﾏｴﾎ､ﾎｽMｳﾉ､ﾇ､ｹ｡｣ｱｾｵｱ､ﾋ､ﾏ｡｢ﾖﾆﾏﾞｽﾍﾋﾘИﾀ�ﾓﾃ､ﾎ･ﾐ･ﾃ･ﾕ･｡､ﾎﾖﾐ､ﾇ､ﾏ､ﾉ､ﾎ､ｯ､鬢､ケ､ｱ､�､ﾎ､ﾇ､ｷ､遉ｦ､ｫ｣ｿ 10｡ﾁAlkaline Phosphatase Reaction Buffer｣ｺ ｡｡1. 5M Tris-HCl, pH7.3 ｡｡125mM glycine ｡｡0. 5% TritonX-100 ｡｡0.25mM ZnCl2 ｡｡2.5mM MgCl2 ｡｡60mM NiCl2 Dilution Buffer ( 1｡ﾁReaction Buffer, Store at ｨC20｡�) ｡｡150mM Tris-HCl, pH7.3 ｡｡12.5mM glycine ｡｡0.05% TritonX-100 ｡｡0.025mM ZnCl2 ｡｡0.25mM MgCl2 ｡｡6mM NiCl2

(無題) 削除/引用 No.2078-44 - 2013/06/12 (水) 07:11:46 - ､ﾝ､ﾋ､� ､ｽ､�､ｫ､魍ｾｵｱ､ﾋ､ﾏ｡｢ﾖﾆﾏﾞｽﾍﾋﾘИﾀ�ﾓﾃ､ﾎ･ﾐ･ﾃ･ﾕ･｡､ﾎﾖﾐ､ﾇ､ﾏ､ﾉ､ﾎ､ｯ､鬢､ケ､ｱ､�､ﾎ､ﾇ､ｷ､遉ｦ､ｫ｣ｿ ｲﾎｿｼ､ﾞ､ﾇ､ﾋ｡｢PAP､ﾋﾌ�ｸｶ､ﾎ｡｢ﾏ｣瘠･ﾐ･ﾃ･ﾕ･｡､�10ｱｶｷｴ場･ﾐ･ﾃ･ﾕ･｡､ﾏｴﾎ､ﾎｽMｳﾉ､ﾇ､ｹ｡｣ 10｡ﾁAlkaline Phosphatase Reaction Buffer｣ｺ ｡｡1. 5M Tris-HCl, pH7.3 ｡｡125mM glycine ｡｡0. 5% TritonX-100 ｡｡0.25mM ZnCl2 ｡｡2.5mM MgCl2 ｡｡60mM NiCl2 Dilution Buffer ( 1｡ﾁReaction Buffer, Store at ｨC20｡�) ｡｡150mM Tris-HCl, pH7.3 ｡｡12.5mM glycine ｡｡0.05% TritonX-100 ｡｡0.025mM ZnCl2 ｡｡0.25mM MgCl2 ｡｡6mM NiCl2

(無題) 削除/引用 No.2078-43 - 2013/06/12 (水) 07:10:21 - ぽにょ 中年さんの御指摘をきっかけに、アルフォスについての当方の知識や考え不足を強く感じましたので、次のように情報を集めて、考えを整理してみました。そして疑問が生じました。 タカラバイオのCIAPについては、次のようなQ&Aがあります。また過去ログをみると、制限酵素処理と同時にPAP処理をする方がいたようなのので、単純にそれにならっていました。 Q:　制限酵素処理後、バッファー置換せずにCIAPを使ってもよいか？ A:　最適条件に比べ数分の1から10分の1に効率が落ちます。しかし通常、大過剰量使用するので、DNAが5'突出末端なら問題ありません。5'陥没末端ならできるだけバッファー置換し、高めの温度（50℃くらい）で使用してください。 当方で使っているアルカリホスファターゼは次（フナコシ、品番DE110）です。低温菌由来アルカリホスファターゼ（ PAP ） 　　 当方の反応系では、5unit/μlの原液を、希釈せずにそのまま制限酵素処理の反応系に添加しています。そのため量の比をみると、5unitを１μｇ未満のDNAに用いているという大過剰な状態です。 添付文書をみると、次の記載がありますので、制限酵素処理後、バッファー置換せずにこのPAPを使ってもよさそうです。 Restriction enzyme buffer (such as low buffer, medium buffer and high buffer) and 1×TE buffer is permissible as a buffer solution of the linearized plasmid DNA. ただし、１ユニットの定義は、次ですので、とても至適なpH条件とは思えません。 defined as the amount required to hydrolyzed 1.0 μmole p-nitrophenyl　phosphate per 1 minute in glycine-NaOH buffer at pH10.5 and 37℃. 次の記載がありますので、blunt endや3’-protruding endに対する効果は弱い反応になるようです。 Incubate for 30 min at 60℃ (blunt end and 3’-protruding end)　or at 37℃ (5’-protruding end) Inactivation by incubation for 5min at 95℃ EcoRIは、次なので、5'突出端をつくる酵素のようです。 5'-G｜AATT C-3' 5'-C TTAA｜G-3' 同様に、NotIも5'突出端をつくる酵素です。 一方、KpnI、次なので、3'突出端をつくる酵素のようです。 5'-G GTAC｜C-3' 5'-C｜CATG G-3' 残る、EcoRVはブラントエンド（平滑端）をつくる酵素のようです。 そのため、EcoRIとNotIで切った端にはやや強めのアルフォス作用を与え、KpnIとEcoRVで切った端には弱い（ほとんど無し？）のアルフォス作用を与えると想像できました。つまり、EcoRIとKpnIのペアと、EcoRIとEcoRVのペアには、片方端にだけやや強めのアルフォス作用を与えていて、EcoRIとNotIのペアには両端にやや強めのアルフォス作用を与えているということになります。 PAPに添付の、希釈バッファや10倍反応バッファを全く使っていない反応系を用いているので、実際にはもっと、アルフォス作用が弱いのかもしれません。 こうやって考えると、制限酵素処理とPAP処理（30 min at 60℃）は、別々にやった方がよいような気もしてきています。PAPは、 10mM Tris-HCl pH7.5、0.025mM ZnCl2、0.25mM MgCl2、そして50% glycerolに入っています。グリセロールのもちこみが過剰で、制限酵素は本当に作用できるのか心配になってきました。 こうやって考えると、単純に、制限酵素処理と同時にPAP処理してもよいのか、疑問です。

(無題) 削除/引用 No.2078-42 - 2013/06/12 (水) 06:35:46 - mon >[Re:41] ぽにょさんは書きました : > monさんのお使いの商品て、次でしょうか？ > DNAクリーンアップ（PCR産物精製、アガロースゲル抽出）MonoFas®DNA精製キット�T はい。サンプルを貰えると思いますので、お試しあれ。もう少し安価だと絶賛出来るのですが。。

(無題) 削除/引用 No.2078-41 - 2013/06/12 (水) 06:00:56 - ぽにょ monさんのお使いの商品て、次でしょうか？ DNAクリーンアップ（PCR産物精製、アガロースゲル抽出）MonoFas®DNA精製キット�T http://www.gls.co.jp/lifescience/monofas/dna_abstraction1/index.html １：MonoFas®シリーズは他社製品と何が違うのか？ •分離剤にシリカモノリスを用いているため、高純度かつ高負荷量でDNAの抽出・精製が行えます。 •通液部分にフィルターを用いていないため、液だまりが生じにくく、微量溶出が可能です。 •シリカモノリスカラムに最適なBuffer組成としており、他社に比べて操作が単純なため、早く、簡便な操作が可能です。（洗浄工程後の空遠心、溶出Buffer添加後の静置不要です。） •操作が単純なため、誰でも簡単に抽出が行えます。 •制御されたシリカモノリスを高い品質管理のもと製造しているため、再現性良くDNAを回収できます。

(無題) 削除/引用 No.2078-40 - 2013/06/11 (火) 23:38:04 - ぽにょ 中年さん アルフォスは半分の1ul(総量20ulの場合）ぐらいにした方が良いでしょうか？あるいはもっと減らした方が良いでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2078-39 - 2013/06/11 (火) 22:59:19 - 中年 議論が煮詰められているところに茶々を入れるようで申し訳ありませんが、私の感覚だとホスファターゼは大過剰に思えます（制限酵素も、かなり）。 最近の酵素はキレイだから余分な活性のコンタミは心配しなくても良いのでしょうが、それにしてもホスファターゼはイヤかも。

(無題) 削除/引用 No.2078-38 - 2013/06/11 (火) 22:35:28 - ぽにょ qqさん、APさん ありがとうございます。それでは次でやってみます。 2ul Alkaline Phosphatase 1ul EcoRI 1ul NotI 1ulプラスミド溶液(1ug/ul) 2ul 10x （H ＋ BSA ＋ Triton X-100） ＊NotI添付品 13ul Water to make 20ul 　 37℃、１時間 皆様、ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2078-37 - 2013/06/11 (火) 19:51:50 - AP >APさん、Kpn1は２ulにして、水を１ul減らします。また37℃、3時間に延長してみます。 そうすると、制限酵素はグリセロール濃度が過剰にならないように十倍以上希釈される系で使用しろというガイドラインを逸脱してしまいますが、まあそれくらいなら問題は起こらないでしょう。 制限酵素反応にTriton X-100やBSAを加えるのは、吸着や希釈によって失活しやすい酵素を安定化するためです。それが必要ない酵素に加えても悪いことありません。

(無題) 削除/引用 No.2078-36 - 2013/06/11 (火) 18:15:26 - qq >ベクターのEcoRIとNotI切断の場合もひとつずつ切ることにした方が良さそうですね そんなに弱気になる必要はありませんよ。慎重になりすぎると、逆に難しくなってしまいます。 私は＋TXでEcoRI+NotIで切りますが、TXなしでも何とかなるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.2078-35 - 2013/06/11 (火) 17:47:48 - ぽにょ qqさん 情報をありがとうございます。ベクターのEcoRIとNotI切断の場合もひとつずつ切ることにした方が良さそうですね。次についてもしお気づきの点があれば、よろしく御願いいたします。特に、Triton X-100が半量になる点が少々気になりますが、まあ大丈夫かな（？）という予測です。 1ul EcoRI 1ul 10x H buffer ＊EcoRI添付品 1ulプラスミド溶液(1ug/ul) 7ul Water to make 10ul 　 37℃、１時間 2ul Alkaline Phosphatase 1ul NotI 1ul 10x （H ＋ BSA ＋ Triton X-100） ＊NotI添付品 1ul 0.1%BSA 5ul Water to make 20ul 　 37℃、１時間

(無題) 削除/引用 No.2078-34 - 2013/06/11 (火) 12:13:06 - qq ＞ベクターのEcoRIとNotI切断の場合 NotIはTriton-X100を入れると良いと、タカラのHPに出ています。

(無題) 削除/引用 No.2078-33 - 2013/06/11 (火) 12:05:36 - ぽにょ cDNAさん、APさん ありがとうございます。 cDNAさん、Cの方法はエタ沈を入れます。 APさん、Kpn1は２ulにして、水を１ul減らします。また37℃、3時間に延長してみます。 すみません、次の切断の組み合わせについても、何かお気づきの点がありましたら、御教授を御願いします。全てタカラの酵素とバッファです。 ベクターのEcoRIとEcoRV切断の場合 (大体10クローニング用) 　4ul Alkaline Phosphatase 　2ul EcoRI 　2ul EcoRV 　4ul 10x H buffer 　2ulプラスミド溶液(1ug/ul) 　26ul Water to make 40ul 　 　37℃、１時間 ベクターのEcoRIとNotI切断の場合 (大体5クローニング用) 　2ul Alkaline Phosphatase 　1ul EcoRI 　1ul NotI 　2ul 10x H buffer 　2ul 0.1%BSA 　1ulプラスミド溶液(1ug/ul) 　13ul Water to make 20ul 　 　37℃、１時間

(無題) 削除/引用 No.2078-32 - 2013/06/11 (火) 10:12:28 - AP >エタノール沈殿は省略したいです。そのため、次のような順番で良いでしょうか？ 良いのではないでしょうか。 Kpn1消化の段階で~20 uLにしておいて、EdoR1消化の時にNaCl溶液で塩濃度を調製する手もあります。 第二消化に移る前に、熱失活するオプションもありますが、たいていの酵素は至適塩濃度より高塩濃度になると切れなくなるだけでスター活性の心配はないので必要ないでしょう。 多くの酵素は、スーパーコイルに対しては1 U/1ug DNAより多くの酵素活性が必要で、どれくらい過剰に必要かは酵素によって異なります。Kpn1はやや切れにくい部類なので、私としてはもう少し足したいところですが、ヴォリュームを抑えたいのでしょうね。その代わり反応時間長めがいいかも。 EcoR1は1時間でじゅうぶんでo/nする意味はないでしょう。 ところでメスアップというのは和製英語らしいです。 英語でmess upというと、めちゃくちゃになる、とっちらかっているという意味です。

(無題) 削除/引用 No.2078-31 - 2013/06/11 (火) 09:33:42 - ｃDNA 私はQIAquick Gel Extraction Kit とQIAEX II Gel Extraction Kit は良く使っていましたが、QIAGEN　MinElute PCR Purification Kitは使ったこと無いので、はっきり分かりませんが、4kbまでという事になってますね。プラスミド、大丈夫ですか？ QIAEX IIで代用すればいいとは思います。 また、Cの方法は脱塩が必要かと思いますが。 些細なことですが、QIAEX IIをカラムではなくビーズとかレジンと呼びます。カラムは筒状のもののことですので。

(無題) 削除/引用 No.2078-30 - 2013/06/11 (火) 08:45:08 - ぽにょ 皆様から頂戴した情報を基に、予備実験的に、次の３つを比較しようと思います。 Ａ．制限酵素処理したインサートの3分の１量とベクターの3分の１量はキアゲン社のカラム（QIAGEN　MinElute PCR Purification Kit #28004）で精製する。ナノドロップ測定をする。この方法では、ゲル切り出しはしないので、ダイマーのコンタミの可能性は残る。 Ｂ．別の制限酵素処理したインサートの3分の１量とベクターの3分の１量については次のように実施する。アガロースゲル泳動（ゲルはSeakemGTG）して切り出した後に、キアゲン社のカラム（QIAGEN　QIAEX II Gel Extraction Kit #20021）で精製する。 エチブロの代替品でより高感度なLonzaのGelStarを用いて、ＵＶ無しで観察する。残留アガロース・残留溶解バッファー・残留エタノールがトラブルの原因になりやすいため、ゲルの凍結融解で凍り豆腐にして出てきたＤＮＡ液をカラム精製用のサンプルにして、アガロースゲルをカラムに持ち込まないようにする。カラムにのせるサンプルが酸性であることも色で確認する。洗いの回数を１回増やす。液を通す遠心のためには、プロトコールで遠心が十秒で良いと書かれていても最低1分は遠心する。さらにその後には、空の状態で1分遠心して、液をぬく。またエタノールをとばすため乾燥を長くする。特にElution bufferを入れる前の遠心は３分間にする。Elution bufferはプロトコルの最低量を入れる。ナノドロップ測定をするが、綺麗なカーブは得られないことが多い。この方法では、得られるＤＮＡ量が少ない可能性がある。 Ｃ．残りの制限酵素処理したインサートの3分の１量とベクターの3分の１量については次のように実施する。アガロースゲル泳動をして切り出したゲルを凍結融解で凍り豆腐にして出てきたＤＮＡ液そのものをライゲーション反応に用いる。この方法では、ＤＮＡの純度に疑問がある。 ＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝ またライゲーション反応は、16℃オーバーナイトとして、インサート10対ベクター１のモル比と、インサート1対ベクター３のモル比の２パターンで、総量15μlで実施してみます。 つまり、３×２の６パターンを比較してみようと思います。

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