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(無題) 削除/引用 No.2077-24 - 2013/06/13 (木) 17:01:08 - サイトカイン ~さん サイトカイン溶液はの濃度が実験毎に異なると困るので、 ~さんが指摘されているように、大量に作製して小分けにしたものを使用しようと考えています。 また、樹立した細胞株を小分けにして大量に保存して、なるべく継代しないようにするつもりです。 骨髄細胞の性質の変化がどこまで許容されるかについては、どの文献を見ても記載されていないのですが、今回の実験は、遺伝子を導入した骨髄細胞から分化した細胞を解析するのが目的なので、骨髄細胞の性質の変化はそこまで影響がないと考えています。 性質の変化が大きいと移植しても分化しないことも考えられるので、移植したマウスの生体内で分化した細胞が得られれば大丈夫だと考えてます。

(無題) 削除/引用 No.2077-23 - 2013/06/13 (木) 09:23:24 - ~ 自作で調整したサイトカインの混合物を用いて骨髄細胞を大量調製すること自体が目的ではなく、その後に増えた骨髄細胞を使って何らかの実験を行うのですよね？ その時に骨髄細胞の性質がどのくらい変わっていることが許容されるのでしょうか？ >文献では、293T細胞にマウスIL3,IL6,SCFのcDNAを挿入したvectorを一過性に遺伝子導入して、そのmediumを使用していると記載しているのですが、毎回、トランスフェクションするのは大変なので、安定発現株を作製して実験しようと思います。 数継代から20継代くらいで発現量が低下する場合があります。 安定発現株が安定に発現しているかは、それぞれのサイトカインについて確認しないとわかりません。 実験の途中で骨髄細胞の性質が変わった場合に、細胞側の問題なのか、サイトカインの濃度の変化の問題なのかを切り分けるのには時間がかかるでしょう。 そのような評価を行いたくないのであれば、 一度に大量に調製してまとめて一液にしたうえでタイターを測り（もしくは細胞増殖能のみで評価し？）、分注したのを長期間にわたって使ったほうが、実験としては安定するかと思います。

(無題) 削除/引用 No.2077-22 - 2013/06/13 (木) 00:38:23 - おお ２９３TはTantigenがはいっているのでSV40oriがあるプラスみどがゲノムにインテグレーションされると、ゲノムの不安定かが引き起こされるようです。そう言う意味でステイブルをとるにはあまりてきさないという指摘もありますが、それでもやられていることは事実です。はつげんに安定せいがえられるかというのが懸念です。

(無題) 削除/引用 No.2077-21 - 2013/06/13 (木) 00:07:36 - おお >[Re:20] サイトカインさんは書きました : > 今回の実験は骨髄細胞をサイトカインで活性化させてレトロウイルスで遺伝子導入して、移植したマウスで生着させることが目的ですので、サイトカインの濃度測定はレトロウイルスが感染すれば何でも良いという判断で省略するつもりです。 まあいいけど再現性が取れないかもよ。 IL-3とかだったら、リセプタのある細胞でグロースやCFUでユニット数を決めるという方法もあるんじゃないかな。

(無題) 削除/引用 No.2077-20 - 2013/06/12 (水) 23:44:42 - サイトカイン 返事が遅くなってしまいました。 いろいろ、教えて頂きありがとうございました。 今まで、悩んでいたことが解決いたしました。 文献では、293T細胞にマウスIL3,IL6,SCFのcDNAを挿入したvectorを一過性に遺伝子導入して、そのmediumを使用していると記載しているのですが、毎回、トランスフェクションするのは大変なので、安定発現株を作製して実験しようと思います。 今回の実験は骨髄細胞をサイトカインで活性化させてレトロウイルスで遺伝子導入して、移植したマウスで生着させることが目的ですので、サイトカインの濃度測定はレトロウイルスが感染すれば何でも良いという判断で省略するつもりです。

(無題) 削除/引用 No.2077-19 - 2013/06/12 (水) 16:28:17 - あ >[Re:17] ポスドクJさんは書きました : > 293Tで一過性に３つの蛋白質をまとめて発現させて、 文献がそうやっていてそれでうまく行くなら、という感じですが、この手の実験は発現させてELISAで濃度を確認して適量を混ぜるのだと思ってました。産生細胞株は面倒ですけど一度作れば安定で・・・

(無題) 削除/引用 No.2077-18 - 2013/06/11 (火) 22:08:50 - Harmonia 実験例としては、human M-CSFを発現させた ttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=16601135 ですね。

(無題) 削除/引用 No.2077-17 - 2013/06/11 (火) 14:21:25 - ポスドクJ 293Tで一過性に３つの蛋白質をまとめて発現させて、培養上清をそのまま骨髄細胞の培養に使うのだと思いました。安定発現株とか精製とかも省略してしまって、うまくいけばオーケーという判断だと思います。

(無題) 削除/引用 No.2077-16 - 2013/06/11 (火) 09:31:07 - あ 一過性に遺伝子導入して、細胞株を作製しようとしていることに誰も触れませんがスルーの方向ですか？

(無題) 削除/引用 No.2077-15 - 2013/06/10 (月) 05:07:33 - ポスドクJ 確認せず投稿してしまい、内容が重複してしまいました。すみません。

(無題) 削除/引用 No.2077-14 - 2013/06/10 (月) 03:58:37 - ポスドクJ 横からで失礼しますが、付け加えさせて下さい。 GenBankの該当エントリーを確認しますと、26-190にsoluble ligand (by similarity) というアノテーションがついてますので、この位置で切断された可溶性型がありうることがわかります。 実際、この位置に特定の酵素によって切断される基質コンセンサス配列があります。 190でなく189で切っている説明はつきませんが、例えば作製時期の古いコンストラクトだと、サブクローニングの都合で多少妥協した設計になっていることがあります。精製のストラテジーの都合とか。文献をさかのぼって行くととこかに書いてあるかもしれない。 切断前の全長は膜貫通領域を含んでいる事も書いてあります。全長を発現させても内在性の酵素が切断した可溶性型は得られると期待できますから、例えばもうベクターがあるなら全長発現もいいし、いまから作るなら可溶性型の設計の方が収量は良いだろうと思います。 すみません、製品情報のページを見ましたらバックグラウンドと文献が書いてありますね。そちらの方が参考になると思います。

(無題) 削除/引用 No.2077-13 - 2013/06/10 (月) 03:17:52 - おお http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_038626.1 sig_peptide 1..25 /inference="COORDINATES: ab initio prediction:SignalP:4.0" /calculated_mol_wt=3010 mat_peptide 26..273 /product="Kit ligand" /experiment="experimental evidence, no additional details recorded" /note="propagated from UniProtKB/Swiss-Prot (P20826.1)" /calculated_mol_wt=27654 mat_peptide 26..190 /product="Soluble KIT ligand (By similarity)" /inference="non-experimental evidence, no additional details recorded" /note="propagated from UniProtKB/Swiss-Prot (P20826.1)" /calculated_mol_wt=18369 Site 215..237 /site_type="transmembrane region" /inference="non-experimental evidence, no additional details recorded" /note="propagated from UniProtKB/Swiss-Prot (P20826.1)" お示しの商品の精製の方法を調べてないので確実なことはいえませんけど。。。 N-末はsignal peptideがあり、endogenousなものはまずsignal peptideの部分を含めて合成されて、ERで合成されている時に切断されるのだとおもいます。 なので、真かく生物に発現ベクターで発言させるときもこのsignal peptideの部分をつけたまま組み込むことがたいていです(つけないで発現させるとERに入らず、細胞質に蛋白がたまります。そうするとER内での修飾などされずに都合が悪いことが多く、分泌もされません--それでもあえてやるというケースがないのかときかれると否定しませんけど)。 この蛋白C-末に膜貫通ドメインがあります。 Site 215..237 /site_type="transmembrane region" これがあると細胞膜にとどまったままです。実際ナチュラルにこの膜貫通ドメインがない物が細胞外に分泌されるのかはしりませんが、solubleなタンパク質として、培地に加えて使うには、この膜貫通ドメインがじゃまです。なぜなら、疎水性がつよくて解けにくくなる可能性があり、蛋白どうしがアグリゲーションする可能性があるからです。 こういう膜貫通ドメインを除いて機能するかどうかはその蛋白次第で、お示しの蛋白はおそらく機能することがわかっているのでしょう。まあ実際にレセプターに結合するのは細胞の外に突き出した部分で膜貫通ドメインは関係ないといえるでしょうけど。 なのでまんまるの細胞で分泌させてせいせいするのなら1aa~189aaをベクターに組み込み分泌されたLys26-Ala189を精製するのがよいストラテジーにみえます。ちなみにLys26からべくたーにくみこんでも、そこからtranslationが始まりませんよ。Metから始まるのはごぞんじですよね。 大腸菌ならsignal peptide をのぞいてlys26の前にMetをいれて発現させるという手法もなきにしもあらずです。

(無題) 削除/引用 No.2077-12 - 2013/06/10 (月) 02:48:02 - ttt ER以降シグナルも以降の効率にvariationがあるそうなので、もしmSCFのシグナル配列があまり効率良くないのであれば収量を上げるために他のシグナルにつなぎ替えることも普通だと思います。 それと、http://www.uniprot.org/uniprot/P20826　によればaa26-190がsoluble Kit ligandとして知られてるようですね。膜タンパクとして発現させるよりも可溶性蛋白として発現させる方が、通常は、収量は多いし精製も簡単なのでそういうことなのではないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2077-11 - 2013/06/10 (月) 02:40:31 - 独り言 さぁ、いますぐに机の上にある細胞の分子生物学を開いてシグナルペプチドもしくはシグナルシークエンスの項目を読んで、どのように分泌タンパク質が小胞体に入り、分泌されるのか。小胞体に入る前と、分泌された後でどのような違いがタンパク質にあるのか考えてみよう。

(無題) 削除/引用 No.2077-10 - 2013/06/10 (月) 01:22:07 - 直輝 それは、1〜25a.a.までが分泌シグナルなので、その部分が切断された状態で分泌されてくるという意味です。 だから、トランスフェクションする際には、1〜25a.a.に対応する部分も含めて全長を遺伝子導入しているはずです。

(無題) 削除/引用 No.2077-9 - 2013/06/10 (月) 00:14:44 - サイトカイン 何度も説明不足ですみません。 以下のサイトで http://www.cstj.co.jp/products/5223.html 「マウスの組換えSCF (mSCF) Lys26-Ala189 (Accession No. NP_038626) をヒトの293 細胞を用いて発現、精製したもの」と記載があります。 mSCFの全長アミノ酸は273aa なのですが、なぜ全長のアミノ酸ではなく26aa~189aaを発現させる必要があるのかについて、納得のいく答えが得られていません。(IL3,IL6も同様です) これに関することを知っている方がいれば教えて頂きたいです。

(無題) 削除/引用 No.2077-8 - 2013/06/09 (日) 06:06:15 - おお あと、全長のcDNAでなくても、その一部をベクターにいれてもリコンビナントといえるわけで、質問者がかんがえているリコンビナントがどのような物かについて(一般定義として全長を含んでいてもリコンビナントですから)回答される方々が不思議に思っているんだとおもいます。 お考えのリコンビナントに関して具体的な説明をして頂けると議論が進むのではないかとおもいます、

(無題) 削除/引用 No.2077-7 - 2013/06/09 (日) 02:12:29 - おお 全長のcDNAをベクターに組み込んだ時点でリコンビナントDNA(組みかえDNA)になります。 もうひとつはサイトカインmRNAはUTRにmRNAを壊す(不安定化させる)しすエレメントがあるものがおおいのでcoding sequence(CDS)の部分だけ使うほうがいいです。とくにまんまるではつげんさせるとき。

(無題) 削除/引用 No.2077-6 - 2013/06/09 (日) 00:43:47 - ｃDNA qqさんが書かれていることがすべてなのですが。 recombinant DNAとは何のことだと思って質問されていますか？

(無題) 削除/引用 No.2077-5 - 2013/06/09 (日) 00:34:57 - 独り言 全長のcDNAと、recombinant のDNA？？？これらは同じ意味じゃないくてぇ？？？ 全長のcDNAはわかるけど、ここでいうrecombinant DNAというのは、何を指しているの？

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