BioTechnicalフォーラム [4% PFA]

4% PFA

No.2075-TOPIC - 2013/06/08 (土) 11:00:28 - おお

みなさんは4% PFAをつくるときにNaOHをつかいますか?
ttp://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/6/pdb.rec11060
ttp://www.cytographica.com/lab/solutions/pfa.htm
　

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No.2075-19 - 2013/08/02 (金) 13:48:25 - AA

単純に純度の問題ではないでしょうか？
ナカライの場合は電顕用のほうが高価ですが、
化学用の場合はPFA溶液を作ると比較的不純物が多いせいか、
もやもやとした溶け残りが結構長く残ります。
不純物については最終的にはろ過してしまいますし、
使っていた感じで固定能にも問題はない用に感じました。
電顕をしないのであれば安い方で良いのではないかと考えています。

(無題)

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No.2075-18 - 2013/08/02 (金) 12:20:15 - グレード

それから和光の化学用グレードを、免疫染色に用いても特に問題が無いと感じているのですが、どういう問題が生じるのでしょうか？

(無題)

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No.2075-17 - 2013/08/02 (金) 12:14:04 - グレード

PFAの使用量が多いラボのものです。

PFAの定価をよく調べると、国産品のものの中には、電顕用と明記されている500g入り商品の方が組織固定用と明記されている500g入り商品よりも割安だったりします。単純に考えると、電顕用の方が高品質なイメージなので、電顕用を購入して、予算を節約して、免疫染色や還流に用いようかと思うのですが、何かグレードの違いってあるのでしょうか？

(無題)

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No.2075-16 - 2013/06/14 (金) 10:40:59 - AP

固定サンプルは最終的には顕微鏡で観察するのが普通ですので、使用する試薬液に粒子状の不純物が混入していると、それが試料に貼りついてノイズの原因になる可能性があります。染色液、発色液しかり、塩溶液しかりです。試薬そのものが溶け残るだけでなく、組織学関連の試薬はもともと不純物、副産物を含むものが多いので、そういうのが粒子としてのこることもあります。その点で、ｆPFA溶液も、濾過すべきものだと理解しています。普通はメンブレンフィルターなんかでなく濾紙で十分ですが。当然、どのくらいの倍率、解像度で観察するかによって、どの程度の不純物が残るとじゃまになるかは変わってきますが。

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No.2075-15 - 2013/06/14 (金) 09:06:53 - AA

>使い分け
なるほど、試薬のグレードで濾過の要不要があるのかもしれませんね。
確かに同じナカライ製でも電顕用と化学用では溶け方に差がありました。

>目詰り
私も、目詰りしたら嫌だなぁ、ということでろ過してから使っています。
ただ、濾過しない人でも胎児の灌流固定をしている人も身近にいまして、
濾過しない＝目詰りする、というわけでもないのかなと思い質問させていただきました。

お答えいただきありがとうございました。

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No.2075-14 - 2013/06/14 (金) 08:27:22 - 組織

>[Re:11] AAさんは書きました :
> 皆さんは最後に濾過を行いますか？

灌流固定の時は溶け残りが目詰まりを起こすと嫌なので、濾過してます。
浸漬固定ではあまり問題ならないと思うので、してません。

NaOHいりませんが、注意が必要です。

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No.2075-13 - 2013/06/14 (金) 00:26:43 - DrCarter

面倒ということもあって、NaOHなしでやっています。
皆さんご指摘の通り、常温だと全然溶けませんので、ホットマグネットスターラーで沸騰しないように攪拌すると30分くらいで溶けます。
待ちきれずに設定温度を上げて沸騰させてしまうと、ホルムアルデヒドが気化して、有害であるだけではなく、濃度も変わってしまいます。
裏技としては、先に粉のPFAを三角フラスコに入れておいて、あらかじめ80℃くらいに熱したお湯を入れると早く溶けるうえ、totalで気化するPFAの量も少ないかと思います。

試薬グレードで溶け残り

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No.2075-12 - 2013/06/13 (木) 17:37:16 - ｅｍａ

うちの研究室では使い分けで
ハイグレードのＰＦＡを溶かした場合は溶け残りも無いのでそのまま使用しますが、通常の汎用版はすこし白っぽく溶け残りがあるようですのでろ過しています。
ハイグレードのは灌流固定で使い、汎用版は組織固定でつけています。

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No.2075-11 - 2013/06/13 (木) 17:07:29 - AA

便乗質問となってしまい恐縮なのですが、、、、

本日この4％PFA/PBを作っている時にふと思い出したので質問させて下さい。

私が習った時には、PFAを溶かしたあと、最終的に濾過(フィルター、濾紙等)するよう教わりました。
それから今まで習った通りで作ってはいるのですが、結構この濾過をしない人を見かけます。
私もその人達も別段問題ないようですしどちらでも良いことなのかもしれませんが、
皆さんは最後に濾過を行いますか？

熱して溶かしています

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No.2075-10 - 2013/06/10 (月) 13:42:53 - さっちょん

先日初めてこの溶液を調製いたしました。

説明の際、
難溶なのでpHを調整した方が良いが、
加熱しても溶ける。
要時調製だから加熱溶解でOK
とのことでした。

実際、４％PFA/PBSを15ml tubeで作り、
tubeにアルミを巻いて
SDS-PAGEのボイル用に温度設定された
ヒートブロックの上においておくと、
溶けています。(1時間後に見たときは溶けていました)

固定当日に調製し、
保存はしない、というプロトコールのようです。

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No.2075-9 - 2013/06/10 (月) 10:34:43 - AP

いきなり4%で溶かすなら（その場合、直接PBSなどのバッファーに溶かすのでしょうが）、NaOHは必要ないでしょうね。
しかし、たいていは水に溶かした8%, 10%, 20%などのストック溶液をつくり、使用時に濃縮バッファーとともに4%に希釈してworkig solutionとします。この場合、NaOHを加えないと無理ですね。PFAを水に入れるとやや酸性を示しますので、NaOHを加えると言っても中性付近、弱アルカリ性になる程度で十分です。

(無題)

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No.2075-8 - 2013/06/10 (月) 07:55:45 - 組織

少量の1N NaOHを使って、DWで8% or 16%PFA水溶液を作ってます。
NaOHを使わないと、粉末がなかなか溶けないのでは？
なんとなく長時間の湯煎を避けたいので、NaOHでさっと作ってます。

最終的にPBかPBSで希釈するので、溶かす段階ではpHに気を使ってません。
昔何回かpHを測った記憶がありますが、特に問題はなかったと思います。

PFAとホルマリンの違いですが、実用上、細胞や凍結切片の免疫染色ではあまり変わらないという印象です。
なので最近は作り置きのホルマリンで済ませています。
ただ、灌流固定とか臓器の浸漬固定の時は、一応4%PFAを用時調製しています。
やり直しがきかないので。

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No.2075-7 - 2013/06/08 (土) 15:22:50 - おお

>[Re:6] maruさんは書きました :
> 粉末を買っていた頃は使っていましたが、電顕用の１０ｍLアンプルに封入された水溶液を購入するようになりました。FACSや免疫染色にしか使いませんが、だいたいは余ります。

たしかに溶液買えばそれですみますね。ホルマリンでもいいのかもしれません。メタノールが入ってますけど。

>[Re:5] AAさんは書きました :
> 私は使わないです。
> ドラフト内で気をつけて加温しながら溶かしています
> 特に厳密な理由があるわけではなく、
> なんとなくpHの上げ下げが正確に出来る自信がないからですが。。。
> (pH試験紙の色の判断など)

ありがとうございました。やはり使わない方もいらっしゃるのですね。いくつかプロとコールみるとpHの調整は不要と見れるものもあります。決まった量入れれば(入れすぎはふせげますし)それでOKなのかなぁという気もしています。

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No.2075-6 - 2013/06/08 (土) 12:36:51 - maru

粉末を買っていた頃は使っていましたが、電顕用の１０ｍLアンプルに封入された水溶液を購入するようになりました。FACSや免疫染色にしか使いませんが、だいたいは余ります。

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No.2075-5 - 2013/06/08 (土) 12:16:43 - AA

私は使わないです。
ドラフト内で気をつけて加温しながら溶かしています
特に厳密な理由があるわけではなく、
なんとなくpHの上げ下げが正確に出来る自信がないからですが。。。
(pH試験紙の色の判断など)

(無題)

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No.2075-4 - 2013/06/08 (土) 11:47:36 - おお

ありがとうございます。NaOHを使わないプロとコールも出回ってましたので、、、ちなみに私もNaOHをつかいます。