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(無題) 削除/引用 No.2070-24 - 2013/06/09 (日) 12:11:21 - なおみ おお様　qk様　ttt様 お忙しい中、多くの情報を頂き有難うございました。 確かにEGTAやEDTAは骨関係の細胞でライセートに入れて使っている論文が多数ありました。何が有効か、一つ一つご教示頂いた事を実践していきたいと思っております。今後ともよろしくお願い申し上げます。

(無題) 削除/引用 No.2070-23 - 2013/06/09 (日) 02:48:32 - おお 単純に乗せる量を1/3とかにできるならそれでもきれいになるばあいがあるとおもいます。特にえいどうがきたなくなる場合。ノンすぺもものによってはへります。

(無題) 削除/引用 No.2070-22 - 2013/06/08 (土) 14:31:38 - おお 確かにえいどうが乱れるとかそう言うのをそうぞうしてました。

(無題) 削除/引用 No.2070-21 - 2013/06/08 (土) 13:55:01 - qk ココで言うバックグラウンドというのが 元々ある明確なバンドがでるサンプルなのに サンプルに含まれる「泳動に影響しそうなモノ（あくまで泳動）が」 泳動を乱した結果、バンドが汚くなってあたかもバックグラウンドのようになる ということをおっしゃっているのであれば、 遠心に意味があるのかもしれませんが、 そもそも４本や５本バンドがあって それを遠心することで、スペシフィックな１本のバンドになる ということを考えているのであれば、 個人的には、それは無いんじゃないかと思いますけどね。

(無題) 削除/引用 No.2070-20 - 2013/06/08 (土) 13:48:27 - おお EGTAのほうがカルシウムと相性がよくなかったっけ。。。でも結晶化してるからどうなんでしょうかねぇ。

(無題) 削除/引用 No.2070-19 - 2013/06/08 (土) 13:23:44 - ttt 石灰化が原因だとわかっているなら、lysis bufferやサンプルバッファーにEDTAを多めに入れたら少しは改善は見込めないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2070-18 - 2013/06/08 (土) 11:49:26 - なおみ おお様　モモ様　qq様 とても参考になるお返事を頂き有難うございました。 おお様のご指摘のごとく、私は骨芽細胞を分化、石灰化させて、細胞内のシグナルを検討しておりますが、石灰化した際にライセートにカルシウムが多量に混入するため、それによると思われるバックグラウンドの上昇、非特異のバンドが、未分化の非石灰化細胞に比べて多く見られるため、困っていました。フィルターにかけるというのは石灰化を除くには有効かもしれないと思いました。是非試させて頂こうと存じます。cangetも昔使っていたのですが、そのような効果があるとは知らずに使っていました。使用を検討させていただきます。今後ともよろしくお願い申し上げます。

(無題) 削除/引用 No.2070-17 - 2013/06/08 (土) 04:11:24 - おお あ、ウエスタンのはなしをしているのですね。。。そうですねぇ。。。超遠心がバックグランドを減らすというのはどうでしょうか。。。一般論でなしにあなたの注目しているタンパクやその抗体またはフィールドでそういう話があるのなら、何らかの理由で有効なのかもしれません。 まあ超遠心がないということなので、代替えとしてできそうなのは0.2umのフィルターを通してみる(吸着性は問題になるかもしれません)。G-25のようなカラムを通してみるとかでしょうか。これらはあまり根拠はありませんが、HPLCの目詰まりを防ぐのに有効なのであなたがじゃまとおもっているものが除けるかもしれません。 まあ可能性としてやれそうなことはほかにもいろいろかけるのですが、、、解決策になるかどうか分かりませんし、、、複雑なものは単なるウエスタンと考えると目的から遠のいているようなきがしますので、、、

(無題) 削除/引用 No.2070-16 - 2013/06/07 (金) 18:43:29 - モモ ライセートの作り方によりますが、細胞質だけを得るような条件の場合、超遠心で細胞骨格が沈殿に行くので、その部分がノンスペとなっている場合には有効なんじゃないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2070-15 - 2013/06/07 (金) 17:55:25 - qq サンプルをもらったまま一度も使うことなく冷蔵庫で眠っている「Can Get Signal」です。私は魔法が嫌いなので、まだ使っていません。（MRの方、申し訳ない。）基本的にはシグナルエンハンサーですよね。

(無題) 削除/引用 No.2070-14 - 2013/06/07 (金) 15:23:32 - なおみ 皆様　 貴重なご経験をご教示頂き有難うございました。大変参考になりました。 qq様に一つだけ質問させて頂きたいのですが、バックグラウンドを低減させるための魔法の試薬とは何でしょうか？もし差支えなければ、お教え頂ければ嬉しいです。よろしくお願い申し上げます。

(無題) 削除/引用 No.2070-13 - 2013/06/07 (金) 14:59:10 - qq >ウェスタンブロットで、バックグラウンドを出来るだけ少なくするために、 1) 自作の抗体であれば、精製しなおす。メーカ−の抗体であれば、メーカーに聞くし、メーカーを変えてみる。 2) ブロッキング剤を変更してみる。 3)　魔法の試薬でバックグラウンドを低減する。 4)　バックグラウンドの原因が推定できるなら、抗体をBG抗原で中和する。

(無題) 削除/引用 No.2070-12 - 2013/06/07 (金) 13:19:43 - 通りすがり 超遠心する理由は分かりませんが、「10万gで1時間と、2万gで5時間の遠心」は同じではないですよ。経験的にはgが大きいほうがよく落ちます。

(無題) 削除/引用 No.2070-11 - 2013/06/07 (金) 04:58:09 - ttt 非特異性なのか交差反応性なのかは分からないけど、それがsolubilityの低いタンパクであれば、SDS-boilの前に超遠心して上清を使うことによって改善する可能性はありますね。もっとも、目的タンパクもsolubilityが低くて落ちてしまうのであれば意味はないと思いますが。

(無題) 削除/引用 No.2070-10 - 2013/06/06 (木) 17:18:42 - Q 超遠心することで非特異的なバンドが消えるということは、無いと思います。 私は聞いたことがありません。

(無題) 削除/引用 No.2070-9 - 2013/06/06 (木) 17:11:10 - み westernの非特異的なバンドがウンヌンというのではなく 流したレーンに沿って高分子領域から低分子領域に渡って尾を引くようなバックグラウンドが銀染色レベルで出にくくなるという感触はあるけど。 おそらくバックグラウンドは脂質成分によるものだと想像していますが。。。 あくまで想像の域なので突っ込まないで下さい。

(無題) 削除/引用 No.2070-8 - 2013/06/06 (木) 14:32:51 - なおみ mbb様 お返事いただき有難うございます。 ウェスタンの際に、非特異なバンドが濃く出るので、抗体濃度などの検討も十分に行ったうえで、さらに出来ることとして、超遠心などの効果を検討しています。それにより非特異バンドが薄くなるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2070-7 - 2013/06/06 (木) 14:28:17 - なおみ おお様 お返事を頂き有難うございました。 ご教示頂いた方法を試してみたいのですが、何か参考となる文献等がございましたら、お教えいただければ大変ありがたく存じます。 お忙しいところを大変お手数ですが、よろしくお願い申し上げます。

(無題) 削除/引用 No.2070-6 - 2013/06/06 (木) 14:26:16 - なおみ i様 お返事を頂き有難うございました。 つまり、10万gで1時間と、2万gで5時間の遠心は、同じ意味（効果が期待できる）を持つと考えてよい、という事でしょうか？お忙しいところを大変お手数ですが、ご教示のほどよろしくお願い申し上げます。

(無題) 削除/引用 No.2070-5 - 2013/06/06 (木) 14:24:57 - mbb バックグラウンドじゃなくて都合の悪い？バンドが みえにくくなるってことじゃないかと思うんですが、 どうなんでしょうか？

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