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(無題) 削除/引用 No.2067-17 - 2013/06/08 (土) 12:26:41 - AA 質問者さんがお答えしない限り実質のところはわかりませんが・・・・ ヘテロな細胞集団に感染/形質転換し特定の細胞集団にのみ発現させたい、 ということでしたので僕の中では勝手にin vivo (or in utero) electroporationのようなもの、あるいは今流行のoptogeneticsを想定していました。 この場合であれば、例えば同じ神経という細胞種のなかのさらに小集団を標的とするので、制限が厳しいでしょう。 こういった小集団のマーカーとなる遺伝子は発現量が良くないので実験として大変そうです・・・・

(無題) 削除/引用 No.2067-16 - 2013/06/08 (土) 01:51:18 - おお >解決したい全体像が、ぼくには分かりません。 Me neither. But it seems that the thread owner does not want to mention it. The owner just said the expression was too weak to conduct the downstream experiment, replying to my question. It is difficult to give other ideas with the information here, but maybe the circumstance surround the owner does not allow to show the details, or just... It is sort of frustrating, though.

(無題) 削除/引用 No.2067-15 - 2013/06/07 (金) 21:31:46 - Harmonia 追加。 少なくとも、トランスフェクションしたときとしていないときで、そのプロ モーターを持っている遺伝子の内在発現が期待通りということは、RT-PCR などで確認していますよね?

(無題) 削除/引用 No.2067-14 - 2013/06/07 (金) 21:27:33 - Harmonia で？なんという細胞を光らせたくて、なんという細胞を光らせたくないのか? そのために選んだプロモーターは何の遺伝子のどのあたりの配列で、参考に した論文は、何?さらに、特定の細胞を光らせて、どんな解析をしたいの？ 解決したい全体像が、ぼくには分かりません。 最初の質問の「特定の細胞だけで発現させたい」っていう状況が、ぼくには 理解できていません。特定の細胞だけを使って、強烈なプロモーターを使う ことができない状況ですか？

(無題) 削除/引用 No.2067-13 - 2013/06/07 (金) 10:09:06 - qk >特定の細胞だけで発現させたいのでプラスミドのプロモーターを入れ替えたのですが、発現しなくなってしまいました。プロモーター部分だけの入れ替えで葉いけないのでしょうか？ >このプロモーターを使った論文があるので、できるとは思うのですが、 最初から、ご自分で答えを出していらっしゃると思いますが？ 問題は質問者さんの手技にあるのでは？

(無題) 削除/引用 No.2067-12 - 2013/06/07 (金) 06:37:50 - かむかむ そうですね。抗体染色してみます。 弱すぎるというのは、発現させたあとの次の実験に使えないということです。 発現を上げるには、どんなエンハンサーを使ったらいいのか、探してみます。

(無題) 削除/引用 No.2067-11 - 2013/06/07 (金) 04:47:54 - おお >[Re:9] かむかむさんは書きました : > 10分の１どころではなさそうです。 > でもこれでは弱すぎるので何とかしないといけないのですが、 > エンハンサーをつなぐというのは、どのようなものをつけたらよいのでしょう 繰り返しになりますが、弱すぎるという判断は何を基準にしていっているのでしょうか。 エンハンサーとはtranscriptional regulatorが結合する配列があり、そのtranscriptional regulatorがプロモーターを活性かするのにひつようなcis elementです。そのtranscriptional regulatorが実際細胞や組織特異的に発現あるいは活性化することで、下流の遺伝子が特異的な(必要な時、場所で)発現する様になっていると考えられています。

(無題) 削除/引用 No.2067-10 - 2013/06/06 (木) 19:54:30 - 独り言 GFPで発現を見ているのですか？ それならば、さらにGFP抗体で染色すると、よりはっきりと発現を見る事ができるはずです。GFPの蛍光って、抗体染色に比べると強くないですから。

エンハンサーをつなぐとは？ 削除/引用 No.2067-9 - 2013/06/06 (木) 17:58:53 - かむかむ トランスフェクション３日目にして、後ろ側にくっつけたGFPが 弱く、まさに真夜中の雲のように、見えてきました。細胞はもう 増えまくっていて自家蛍光のような気もするのですが・・・ 10分の１どころではなさそうです。 でもこれでは弱すぎるので何とかしないといけないのですが、 エンハンサーをつなぐというのは、どのようなものをつけたらよいのでしょうか？ 経験がないので、参考になるものがありましたら教えていただけますと 助かります。

(無題) 削除/引用 No.2067-8 - 2013/06/06 (木) 11:52:11 - 独り言 細胞特異性のあるプロマーターは概して、発現が弱いので、CMVなどみたいに一過性とランスフェクションでも、かなり弱く発現する場合があると思います。プロモーターによると思うけど、１０分の一以下とか。 そもそも細胞特異的なプロモーターを一過性トランスフェクションで、特定の細胞にだけ発現させるのはかなり難しいのでは。というのは、細胞特異的でも、大量にトランスフェクションされた他の細胞でも発現してしまうだろうし、かといって、トランスフェクションは細胞によって導入される量はマチマチだし。 いや、というか、どういう実験系かわからないので、培養細胞のことを書いてしまいましたが。

(無題) 削除/引用 No.2067-7 - 2013/06/06 (木) 10:46:28 - AA 特異的なプロモーターですとそれを積んだプラスミドがない、または手に入りにくいことも多々ありますので、質問者様のように自分で載せ替えることはよくやられていると思います。 問題は、一般的なプロモーター(CMVなどよく出回っているもの)と比べるとプロモーターの配列の長さが長いことがよくある気がします。 あまり大きなプラスミドになってくると今度は細胞ないし個体への遺伝子導入の際の効率も関わってくるのではないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2067-6 - 2013/06/06 (木) 08:08:42 - おお プロモーター/エンハンサーにもよるでしょうけど、CMVなどと比べると弱いということはあり得るとは思います。 弱いというのも実験で検出がしにくいという尺度と、生理的になにか引き起こすという尺度も違いますし、そうすると検出に工夫が必要なだけかもしれませんよ。 エンハンサーをタンデムにつなぐことでもしかしたら強くなるかもしれませんが、たの細胞でもリーク程度にでてくるかもしれません。試行錯誤もそういう意味では必要かもしれません。

(無題) 削除/引用 No.2067-5 - 2013/06/06 (木) 07:48:54 - a インサートを別のプラスミドに入れ替える方が早いのでは？

ポジコンは… 削除/引用 No.2067-4 - 2013/06/06 (木) 07:24:33 - かむかむ このプロモーターを使った論文があるので、できるとは思うのですが、 …そうですね。ポジコンはないです。 ただ、いれた遺伝子によっては、弱く発現しています。 発現しなくなったのは、もしかしたら発現が弱すぎるとも考えられます。 それでもこのプロモーターを使う必要があって、 どうにかしたいと思っているのです。

(無題) 削除/引用 No.2067-3 - 2013/06/05 (水) 21:37:24 - Harmonia 発現しないのが、正解だったりして。 そのプロモーターが働くということのポジコンは何ですか？

(無題) 削除/引用 No.2067-2 - 2013/06/05 (水) 16:01:11 - おお ちょっと具体的にどう作ったかわからないので様子がわかりませんが、一般論として入れ替え可能です。

プラスミドのプロモーターの入れ替え 削除/引用 No.2067-1 - 2013/06/05 (水) 15:13:30 - かむかむ 特定の細胞だけで発現させたいのでプラスミドのプロモーターを入れ替えたのですが、発現しなくなってしまいました。プロモーター部分だけの入れ替えで葉いけないのでしょうか？

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