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(無題) 削除/引用 No.2059-4 - 2013/06/04 (火) 01:45:02 - おお ラベルしたものはTCAで沈殿させて、フィルターに吸着して測ることが多いので、リカバリーはあまりしないでしょうね。まあ尿素とか使ってリカバリーしてということはされているようですけど。 まず通常のタンパク用のライセーとをとってタンパク定量してから一定タンパク量をTCAで沈殿させる方がいいのではないかとおもいます。 特定のタンパクなららいせーとをとってIPしてSDSPAGEでしょうか、、、

(無題) 削除/引用 No.2059-3 - 2013/06/03 (月) 22:38:04 - qq 35S-Metで標識するとき、Met-freeの培地を使っていますか？ 普通のDMEMなどでは、培地に含まれるMetで希釈されてしまいますから、標識の程度は、かなり弱くなります。

(無題) 削除/引用 No.2059-2 - 2013/06/03 (月) 22:32:39 - qq あなたは、MEF細胞のタンパク量を適切に測定できますか？ できるのであれば、その方法で用意したサンプルを2等分して、一方をタンパク定量（BCA-Assay?）して、もう一方をTCA沈殿して、その酸不溶性画分の35Sを液シンで測定すると良いのではないでしょうか？ TCA沈殿したタンパクは、グラスフィルターにトラップして、冷メタノールなどで洗浄した後、フィルターのまま液シンで測定するのが、普通かもしれません。 TCA沈殿をエーテルかアセトンでリンスしてTCAを除去し、2% SDS＋6M UREA＋50mM Tris-HClなどで溶解するのも良いかもしれません。 RIの実験技術は、現在、失われかけています。できるだけRI実験を行ったことのある指導者に直接指導を受けてください。RIを使わないで一度、パイロット実験を行ってみるのは、決して無駄ではありません。出たとこ実験は思わぬ事故のもとです。 ＞素晴らしい研究者が多いこのサイトで、一流の応えをこの若輩学生にご鞭撻よろしくお願い致します。 この最後の文章は丁寧かつ非礼です。慇懃無礼と申します。

35-S　incorporationについて 削除/引用 No.2059-1 - 2013/06/03 (月) 20:47:24 - ｄｊヴぉぶｇ 皆様こんばんわ 私は、現在ある薬剤の添加によってタンパク質の翻訳に影響があるかを調べるために、35S-methionineの取り込み実験を行っています。 使用している細胞はMEFで、35S-methionineで1hラベル後に、TCA沈殿した後に、シンチレーションカウントでcpmを測定し、BSA assayで全タンパク質量で補正しようと考えているのですが、前回まではTCA沈殿後に、RIPAbufferでペレットを溶かそうとしても溶けなかったため、再度遠心して上清をそれぞれで計測したものの、サンプル間でのバラつきが大きくなってしまいました。（溶けてる度合いが揃っていないので、当然ですが・・・） 調べた結果、35Sのエネルギーが低いため、液体シンチレーションを沈殿後のペレットに直接加えると、cpmの値は良好だったのですが、当然その後にBSAassayは不可能になってしまいます。 沈殿をなんとか溶かすべきなのでしょうが、同じような実験をしている論文を読むと、cpmは不溶性画分で測定しているようなのですが、どのようにタンパク質量でその後の補正を行っているのかわかりません。 素晴らしい研究者が多いこのサイトで、一流の応えをこの若輩学生にご鞭撻よろしくお願い致します。

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