全6件 ( 1 〜 6 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

ありがとうございました！ 削除/引用 No.2056-6 - 2013/06/03 (月) 19:26:14 - にゃんすけ APさん。中年さん。 ありがとうございました！ 非常に分かりやすく参考になりました。 アンピシリン耐性ということを曖昧に理解していたんだと反省しました。 よくよく考えれば分かる事なのに、恥ずかしいです。 しかも、FAQだったんですね。よく検索してれば良かったです。 お手数おかけしました。 プラスミドが採れないなんて、どんなスランプだ！と落ち込み、冷静さを欠いてました。 ありがとうございました！

(無題) 削除/引用 No.2056-5 - 2013/06/03 (月) 17:43:09 - 中年 液培から植え継いでプラスミドの収率が落ちるというのは、このフォーラムではFAQです。APさんがお書きになっているように、アンピシリン耐性遺伝子産物のβ-ラクタマーゼは分泌性酵素で、o/nカルチャーだと培地の中にしこたま溜まっています。それを培地ごと本培養に植えたら、入れた瞬間に本培養の培地のアンピシリンは全部分解されるでしょう。 24時間の培養でプラスミドが落ちるというのは正確ではないように思います。問題はアンピシリンの選択が掛からなくなってしまうことと、今回のプラスミドが大腸菌にとって「やや」嫌われていることです。たとえプラスミドを失った菌が前培養のごく一部であったとしても、失った菌の方が生育が早いようなら本培養を乗っ取ってしまうことになります。

(無題) 削除/引用 No.2056-4 - 2013/06/03 (月) 17:22:46 - AP >２mlの培地で24時間も培養してしまうと、プラスミドが落ちるのではないかと思います。他の人の意見を聞いても同様の意見でした。 ちゃんと抗生物質が入っていればセーフの範囲だとは思いますが。 スケールアップしたときにも抗生物質が入っているはずですから、プラスミドの落ちた細胞がいても淘汰されるはずですね。 ただし、アンピシリン選択の場合はラクタマーゼが培地中に放出されて、菌体内に取り込まれた分だけでなく培地中のアンピシリンを分解したり、植え継いだ時に大量に持ち込まれる可能性があること、アンピシリン自体があまり安定でないこと（培養に伴うpHの低下などで効かなくなる）があります。そのせいで培養中のアンピシリン力価が低くなっている可能性はあります。 たとえば、植え継ぎの時、軽く遠心して上清のベータラクタマーゼを含んだ培地を捨てて、菌体だけを植え継ぐようにするとか、2 mLの前培養を全量植え継ぐのではなく、ボリュームを減らすとかすると改善するかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.2056-3 - 2013/06/03 (月) 17:20:06 - おお 培養時間がながすぎると、取れなくなったり収量が減ったりする"可能性"があるのはたしかです。ま、いずれにしろやりなおすでしょうし、その時にしっかりやればいいんじゃないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2056-2 - 2013/06/03 (月) 17:05:11 - e 普通に取れますが。 腕の問題では？ それとも特殊なプラスミドですか？

プラスミド抽出における大腸菌培養について 削除/引用 No.2056-1 - 2013/06/03 (月) 16:42:36 - にゃんすけ midi prep のプラスミド抽出時の大腸菌培養について教えてください。 今、ちょっとイレギュラーな事が起こっており困っています。 私は今まで、プラスミド抽出での大腸菌培養は、以下のように行っていました。 2mlの培地にコロニーをピックアップ。 ↓ 8時間ほど培養。 ↓ 400ml の液体培地に菌液を加える。 ↓ maxi prep のキットで精製。 今、別の人からプラスミドを抽出してほしいと依頼があり、プラスミドを採っています。 ですが、その人のやっていることを聞くと、2mlの培地にコロニーをピックアップしてから、取り上げるのを忘れていて24時間培養してしまい、その菌液を250mlの液体培地に入れてO/Nで培養した大腸菌だというのです。 ２mlの培地で24時間も培養してしまうと、プラスミドが落ちるのではないかと思います。他の人の意見を聞いても同様の意見でした。 案の定、思うような濃度のプラスミドが採れずに、困っています。 私的には、24時間培養の時点で怪しいのではないかと思っています。 皆さんのなかで、24時間のプレ培養でもプラスミドを採られているかたはいらっしゃいますか？ また、24時間プレ培養では採れなかった経験のある方はいらっしゃるでしょうか。 このままでは、何が原因なのかが分からないので前に進めず困っています。 とりあえず、私がいつもやっているとおり、プレ培養8時間→250mlでO/Nの培養。でやり直そうとは思っているのですが。

全6件 ( 1 〜 6 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---