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(無題) 削除/引用 No.2050-13 - 2013/06/04 (火) 08:02:49 - 組織 ハイブリバッファーは自作できますが、個々の試薬を持ってないと余計にコストがかかるので、既製品がいいかもしれません。 洗浄や検出系のバッファーはRocheから売られてますが、自作した方がお得かもしれません。 抗DIG抗体はRocheがそこそこ安いです。 他はAAさんと同意見です。

(無題) 削除/引用 No.2050-12 - 2013/06/03 (月) 21:04:50 - AA Rocheのラベリングキットですが、組み合わせを変にいじる必要はないと思います。 DIGラベリング実験のマニュアル冊子(確か今第3版だったかな)はかなり充実したものを配布していますし、 なんならラボの新入生に読ませて勉強させるレベルでよくできています。 組み合わせというのとは違いますが、プローブ配列をのっけるベクターによってはポリメラーゼに不要なものが含まれていたりします。(SP6が要らない、等) キット内のチューブは内容量が少なめなので、バラバラに買ったほうが効率よく買えるということはあるかもしれません。 発色もRocheの基質で良いと思います。金額が高いのが気になるのであれば、各基質(NBT、BCIP、INT、等)を別個で購入し、溶かすと良いです。

(無題) 削除/引用 No.2050-11 - 2013/06/03 (月) 19:32:46 - in situ未経験者 情報をありがとうございます。 固定などの方法は参考にいたします。 プローブの作成方法と検出方法については、結局、ロシュのテクニカルサポートに問い合わせることにしました。どうも他社の競合キットというのはあまり無さそうですので。 ただ、もしロシュのこのキットは、どこそこ社のこれとこれを組み合わせれば、安くなる、とか、より優れている、ということがありましたら、教えていただけると有り難いです。

(無題) 削除/引用 No.2050-10 - 2013/06/03 (月) 05:27:23 - 通りすがり In situかなりやりこんでいた時期があります。プローブ作成のキットは他の方も行っているように、Rocheのラベリングキットが最善と思います。 　プライマーの設計に関しては、以下のサイトで検索できるかもしれません。これはマウスの脳に発現している遺伝子を網羅的にIn situしているのですが、脳「特異的」遺伝子というわけではないので、目的の遺伝子のものも見つかるかもしれません。 http://www.brain-map.org/ 　また、固定ですが、私の経験上、還流固定をして、浸漬固定もしていたほうがかえってｍRNAの保持がよく、シグナルが強いということがありました。最初は未固定で切ってから切片を固定していましたが、この方法はもうやっていません。

(無題) 削除/引用 No.2050-9 - 2013/06/03 (月) 05:08:20 - 独り言 in situならDIGでよければ、Rocheが細かい説明付きのプロトコールを公開していて、希望すれば冊子ももらえるんだな。 http://roche-biochem.jp/prima/prima_molecular_biology/dig_for_in_situ_hyb/index.html とりあえず、未固定の凍結組織をスライス後に１0分ぐらい固定した組織でやってみるところから、初めてみるのがいいかも。でも、まず第一に絶対うまく行くプローブでポジコンを作って、やってみないとね。in situがワークしているラボに絶対うまくいくポジコンを教えてもらわないとね。 in situの感度はプローブの善し悪しに大きく左右されちゃうんだな。あたりまえだけど。 でも、自分一人で立ち上げるのはきっと時間がかかる。せめてノザンブロットの経験があれば。時間がないなら、ワークしているラボに習いにいった方が絶対いいんだな。

(無題) 削除/引用 No.2050-8 - 2013/06/03 (月) 04:05:36 - おお 失礼しました。読んでいる側として、in sit。というのも、自分が投稿するとき考えてもいないレフェリーの要請があれば対処が難しくなりますから。そう言う情報をシェアしていただければとちょっと思ったのがこめんとのきっかけでした。 当方経験はございませんが、現在所属のラボではむかしやってたひとがいまして(といってももう10ねん以上前になるのですが)、ほぼrocheのキットですましていたようですDIGを使ったラベルです。 じかんがあればもうちょっとさぐってみますが、、、まあ昔の商品なのでそれに完全に相当する商品があるのかとかちょっとおもいますけど、、、 もうひとつきになったのはご質問の状況でin situをその様な状況で要求するということは、たんにmRNAが存在する以上のデーターを考えているのかもとおもえたりするわけで、そうすると上記のスタンダードのきっとでだいじょうぶなのかともおもえたりしました。これは回答の妥当性にかかわりますので。 還流固定なしのサンプルの対処方法はヒトのオートぷシーやバイオプシーでどの様に対応しているか見られるといいかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.2050-7 - 2013/06/02 (日) 16:54:36 - in situ未経験者 おおさん おっしゃりたいことは判りますし、そのような状況もあると思いますが、当方の求めている情報ではないですので、これ以上のやりとりは御勘弁してください。 どなたか、当方の最初の質問に対する情報をお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.2050-6 - 2013/06/02 (日) 14:17:23 - おお >[Re:4] in+situ未経験者さんは書きました : > 免疫染色やWBに使う抗体が、目的動物種用の > ものが無いので、他種用を流用しています。 ハエの蛋白をまんまるの遺伝子から作った抗体で検出したりとか、逆の時とかまあまあありますけど。反応して特異性があればそれでいいと思うのですが。。。

(無題) 削除/引用 No.2050-5 - 2013/06/02 (日) 13:44:50 - in+situ未経験者 また、免疫染色やWBに使う抗体として、目的動物種用のものが無 いので、他種用を流用したけれども、うまくワークしなかった という経験もあります。 そのようなときには、in situができたら良いのになーと、 今まで思い続けてきました。

(無題) 削除/引用 No.2050-4 - 2013/06/02 (日) 13:41:29 - in+situ未経験者 免疫染色やWBに使う抗体が、目的動物種用の ものが無いので、他種用を流用しています。 in situなしで済ませようと考えたのですが、 レフェリーからin situの追加を要求されて います。

(無題) 削除/引用 No.2050-3 - 2013/06/02 (日) 11:01:59 - おお in situなしのpublicationはかなり見られると思いますので、、、

(無題) 削除/引用 No.2050-2 - 2013/06/02 (日) 11:00:32 - おお ちょっと質問ではないところで逆質問になってしまいますが、in situがひつようなのはなぜでしょうか。mRNAの細胞内局在などのデーターが必要なのでしょうか。

凍結切片内のmRNAのためのin situハイブリのお薦めは？ 削除/引用 No.2050-1 - 2013/06/02 (日) 08:45:32 - in situ未経験者 どうぞよろしくお願いします。 凍結切片内のmRNA（タンパクのコード部分は約1000bp）のためにin situハイブリをするための、プローブ作成、標識、検出の段階での推薦される商品（キット、あるいは単品）を紹介してください。 これまで哺乳動物の凍結切片に対し、HRP標識第2抗体とDAB、あるいはAlexaFluor標識第2抗体を用いた、免疫染色をしてきました。 これまでに集めた組織は、還流固定できない動物種のために、材料採取 後に、4%PFAでオーバーナイト固定し、スクロース液で処理した後に、 マイナス８０℃で保存したものです。 この他に、還流固定無しの材料採取後に、液体窒素で急速凍結しマイナ ス８０℃で保存した、未固定のものもあります。 今まで、in situハイブリは難易度が高そうなので実施しないで済ましてきました。論文では、イントロでは他種での状況を紹介し目的組織に当該mRNAがあることを書いて、M＆MではRTPCR（またはリアルタイムPCR)とウエスタンと免疫染色だけの実施で済ましてました。しかし、とうとうそんな事も続けられない状態になりました。 以上、お恥ずかしいレベルですが、初心者にも扱い安い商品の組み合わせを、どうぞ御教授をお願いします。

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