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(無題) 削除/引用 No.2044-6 - 2013/05/31 (金) 23:58:02 - 中年 30クローンをチェックしてpositiveが無かったということですが、例えばプレートに出てきた全てのコロニー（100クローン？1000クローン？それ以上？）を全てまとめて掻きとって、その中に（頻度は少なくとも）positiveが含まれているかどうかをＰＣＲでチェックしてみてはどうですか？ もし、頻度は低くともpositiveが含まれるなら、あとは同じＰＣＲを指標にsib-selectionをすれば、シングルクローンに行き着くのは難しいことではないと思います。

(無題) 削除/引用 No.2044-5 - 2013/05/31 (金) 16:26:24 - kiki maruさん，ありがとうございました。 70-100baseでうまくやっておられるんですね。 早速，ホモロジーアームを100baseにする設計をしました。 相同組み換えは初めて行うので，ほかの遺伝子については全くわかりません。 でも，隣の研究室の経験者さんに伺ったら， （その方はカウンターセレクションの系ではなかったのですが） やはり50では短く，染色体のどこかわからないところにインテグレーションしてしまうという経験をされていました。 結局，ホモロジーアームは500にされているそうです。 maruさんのように100でうまくいけばいいのですが， うまくいくところまで，長くしていくことにします。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2044-4 - 2013/05/31 (金) 12:15:01 - maru RED/ETで遺伝子をかなりつぶしましたが、頻度が低かったことは何度かあるのですが、ターゲッティングされなかったことはないです。。。私はいつも７０ｂｐか１００ｂｐでやっていて（学内に自前のオリゴ合成施設があって長さを気にしなくていいので）、１００ｂｐのほうが外れが出にくいかなとおもってますが、ほとんどはほぼ１００％で取れるので気のせいかもしれません。設計は間違いないんですよね？同様の設計で別の遺伝子に変異を入れたことはありますか？

(無題) 削除/引用 No.2044-3 - 2013/05/31 (金) 09:03:19 - kiki maruさんありがとうございます。 目的の遺伝子にrpSL-neoが挿入されたとしても，致死ではないです。 コロニーは３０個拾ってみましたが，，，， すべて，kanamycin-R, streptomycin-Sで薬剤感受性の変化はOK, rpsL-neo はPCRで増幅， 目的遺伝子のPCRでは挿入されていない大きさが増幅してくる ということです。。。 やはり，ホモロジーアームを長くするのがいいでしょうか。 maruさんは長くしてよかった経験がおありですか？ このキットは「わずか50baseのホモロジーアームで組み換えOK!」 と宣伝されてる感じだし，それを信じるなら間違いのないプライマー設計のはずだし。 「あ，それなら長くしてみたらいいよ」 という経験者がどのくらいいらっしゃるものか，もしご経験がおありでしたら， maruさんはじめ，他の研究者の方，教えてください。

(無題) 削除/引用 No.2044-2 - 2013/05/31 (金) 03:32:45 - maru 組み換えの確認をどうやっているのかわからないのですが、それが正しいとして、まれに組み換わりにくいローカスはあります。その場合、コロニーを１２-２４位拾って、ポジティブクローンを選別します。通常は薬剤耐性で生えたコロニーはほぼ１００％で正しく相同組換えしています。たくさん拾ってダメならアームの長さを７２−１００ｂｐくらいに伸ばしたらどうでしょうか。 その変異や遺伝子破壊は致死性ではないことはわかっていますか？

pRED/ETを使った相同組み換え，うまくいきません 削除/引用 No.2044-1 - 2013/05/30 (木) 17:18:14 - kiki counter sélection BAC modification kit（pRED/ETのシステム）を使って， 大腸菌の染色体に１塩基変異を入れようとしています。 HB101株とTOP10株で試しましたが， rpSL-neoカセットはどこかに組み込まれるようなのですが， 目的の遺伝子中には組み込まれません。 （薬剤感受性の変化を確認し，PCRでも確認をしているので， 多分そういうことだと考察しています） rpSL-neoカセットを増幅するときには50baseのホモロジーアームを付加しています。 このフォーラムにどなたかが書かれていた事があると記憶していますが， ホモロジーアームが50 baseだと短くて， 大腸菌の染色体にランダムにrpsL-neoカセットが組み込まれる事があるとか。 そのようなことは，よくあるのでしょうか。 キット中のコントロールの実験は，うまくできております。 なので，私たちの実験では，プライマーの設計になんらかのミスがあるのだとは思いますが， いまのところ，正しく設計しているはずなのに，と思うばかりです。 何か，対処法がありましたら，教えていただければ幸いです。

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