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(無題) 削除/引用 No.2041-6 - 2013/05/30 (木) 01:20:16 - 直輝 そういえば、疑問に答えてなかった。 凍結保存したペレットでいいのか？⇒OK この保存方法は正しいのか？⇒-80℃にすべきだけど、大抵のタンパクは-20℃で１ヶ月ぐらいなら平気。 可溶化後遠心して上清を使うべきではないのか？⇒本来はそう。でも、バンドがでなかった原因とは思いにくい（理由は下に書いたとおり）。 溶解液はこれでいいのか？⇒OK ほとんど発現してないとか、抗体がしょぼいとか、他の原因があるように思います。

(無題) 削除/引用 No.2041-4 - 2013/05/30 (木) 01:11:50 - 直輝 可溶化といったら、普通は可溶化した後に遠心して上清を使います。 でも、それがバンドが出なかった原因かどうかは疑問です。 なぜなら、遠心せずにウェスタンしたということは、可溶化されたモノも、可溶化されなかったモノも、全部まとめてみたわけで、全体を見てなかったんだから、膜画分だけとってきても見えない可能性が高いです。 （もちろん、目的のタンパクが薄まるとか、バンドが汚くなるとかはあるだろうけど、全く見えなくなるとは思いにくい）

(無題) 削除/引用 No.2041-3 - 2013/05/29 (水) 14:48:45 - おお 蛋白用の試料は-80度のほうがいいのではとおもいました。それ以外は情報にある部分だけをみるとそんなにおかしくないです。 細胞ペレットのほぞんじゃなくって、PBSのぞいてから、lysis用バッファーをくわえて-80度保存でもいいかと思います。 膜蛋白なら、RIPAほど溶出力のつよいバッファーでなくてもいいかという気はします。夾雑物が少ない方が目的の蛋白が多くなるであろうというてんではそうしたほうが検出に有利なことはまあまああるとおもいます。ただし今回検出できなかった原因かはわかりません。 定量とかいう前に一度膜フラクションだけとってきて(ちゃんと発現しているさいぼうから)WBをしたりして、べすとなWBのコンディションを見極めるというのもありかと思ったりもします。

(無題) 削除/引用 No.2041-2 - 2013/05/29 (水) 14:29:27 - 独り言 膜タンパク質といってもいろいろあるんだなぁ。 WBで問題になる場合は、大抵、「複数回貫通型膜タンパク質』なんだなぁ。

膜蛋白の抽出について 削除/引用 No.2041-1 - 2013/05/29 (水) 13:49:32 - ちーず 細胞株からの膜蛋白抽出、ウェスタンブロッティングをしたいと思っています。 教えてもらったプロトコルは以下の通りで一度目はうまくバンドがでませんでした。 �@dishからスクレーパーにて細胞剥離し遠心、上清吸引しペレットにPBSを少量加え分注し再度遠心。上清を吸引しペレットを―20度で保存。 �A上記保存していたペレットを用いて実験。 ペレットにRIPAbuffer,SDS,DDW加え可溶化。vortexするだけ。 �Blowry法で蛋白定量 �C電気泳動、WB 今回は膜蛋白の発現のみ定性的に見たいと思っています。 疑問点は、凍結保存したペレットでいいのか？この保存方法は正しいのか？ 可溶化後遠心して上清を使うべきではないのか？ 溶解液はこれでいいのか？ などです。初心者で申し訳ありません。バンドが出なかったので膜蛋白抽出方法を変えた方がいいかもと言われましたが細胞ペレットの作成含め、これを利用していいのか、可溶化後上清を使うのではないかなどわからないことばかりです。よろしくお願いします。

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