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3'RACE (SMARTer RACE cDNA amplification kit)について。 トピック削除
No.2025-TOPIC - 2013/05/23 (木) 14:30:34 - iaminert
宜しくお願いします。

clontechのSMARTer RACE cDNA Amplification kitを用いて3'RACEを行います。
kit付属の3' RACE CDS primerの配列が

5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC(T)30VN-3'
N=A,C,G or T, V=A,G or C

となっています。
ここでVにTがないのはなぜでしょうか？
もしサンプルのpolyA直下塩基がAの場合は相補的なプライマーでないということになってしまいませんか？（1塩基異なるだけなのでcDNA合成はされると思いますが）

あさっての方向の質問でしたらすみません。
その点も含めて、ご意見いただけますでしょうか。
　
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(無題) 解決済み 削除/引用
No.2025-9 - 2013/05/28 (火) 17:55:44 - iaminert
pumkinさん

お答えいただきありがとうございます。
自分の解釈に自信がなかったので大変助かりました。

確かに実際3'RACEをやってみたらどのクローンもすべて違う配列になっていました…。
一つだけコンセンサスと同じ配列があったのですが。

どうもありがとうございました。

(無題) 削除/引用
No.2025-8 - 2013/05/27 (月) 15:29:10 - Pumpkin
@
>プライマー5'---AC(T)30VN-3'があり、
>ここで、鋳型が ACTTA (A)nの場合、(n≦30)
>polyAの前のAには、30個目のTが結合し、
>シークエンスの結果では
>ACTT(A)30　となる、という考え方でよろしいでしょうか？

その解釈でOKです。

A
>ACTT(A)30というシークエンス結果が得られたとき、
>3'末端がAで終る可能性がある場合は
>末端配列はACTTとCTTAの可能性が考えられる

その解釈でOKです。
この場合、ACTT+(A)30かACTTA+(A)29となるんでしょう。
しかしこの区別はつきませんね。

しかし、そうは簡単な話ではなくて、
3'RACEをおやりになればわかりますが、PolyAとして出てくる数は
いつも30というわけでなく、まちまちです。
数十遺伝子の全長を決めてきていますが25〜35個と幅があります。

(無題) 削除/引用
No.2025-7 - 2013/05/27 (月) 11:15:55 - iaminert
pumpkinさん、ありがとうございます。

すみません、理解が追い付かずに質問おゆるし下さい。

>[Re:6] Pumpkinさんは書きました :
> >もしこのmRNAの3'末端がAで終るというコンセンサスがあって
>
> といっているのだから、−ACTTAのA位置にPolyAが付加されるのでは？
> つまり、−ACTTA+(A)n。
>

プライマー5'---AC(T)30VN-3'があり、
ここで、鋳型が ACTTA (A)nの場合、(n≦30)
polyAの前のAには、30個目のTが結合し、
シークエンスの結果では
ACTT(A)30　となる、という考え方でよろしいでしょうか？

逆に
ACTT(A)30というシークエンス結果が得られたとき、
3'末端がAで終る可能性がある場合は
末端配列はACTTとCTTAの可能性が考えられる、と思ったのですが

どこか考え方に誤りはありますでしょうか？

御手数おかけしますが御教授お願いいたします。

(無題) 削除/引用
No.2025-6 - 2013/05/23 (木) 19:31:20 - Pumpkin
>もしこのmRNAの3'末端がAで終るというコンセンサスがあって

といっているのだから、−ACTTAのA位置にPolyAが付加されるのでは？
つまり、−ACTTA+(A)n。

でもって、先ほどの回答で嘘ついてしまったけど、
ゲノム配列があってもそれがpolyAなのかplyA付加サイトのAなのか
判断つかないですね。謝ります。

(無題) 削除/引用
No.2025-5 - 2013/05/23 (木) 17:11:23 - iaminert
中年さん、おおさん、pumpkinさん、コメントありがとうございます。
大変参考になりました。

3’末端がAでの問題がないことは理解できました。

つまり3'末端がA以外の場合はVと相補的になるところが3'末端部分、
3'末端がAのときにVと相補的になるのは、3'末端の1塩基上流、という解釈すでいいのでしょうか？

もしこのmRNAの3'末端がAで終るというコンセンサスがあって、
シークエンスの結果、例えば

----ACTT A(30)

という結果が出た場合、考えられる3'末端配列は
ACTTかCTTAのどちらかの可能性がある、という考えになるのでしょうか？

(無題) 削除/引用
No.2025-4 - 2013/05/23 (木) 15:35:38 - おお
Vの手前でTすなわちpolyAが終わりということでこれをいれないとVの部分がTでそのあとも全部T(すなわちおりごdTと何ら変わらないプライまーがふくまれてしまうことになります。VのぶぶんはpolyA がおわって違う配列がきている場所ということなので、とくになにか排除されるわけではないと思います。

(無題) 削除/引用
No.2025-3 - 2013/05/23 (木) 14:57:23 - Pumpkin
そもそもPolyAは長さがまちまちなので、(T)30は十分PolyAを捕捉できる長さになっています。で、Nの後ろがTであった場合でもこれで伸びますよね？だから相補的な配列だと思うのですが。

polyA由来のAか3'UTRのAかはゲノムとアライメントすればわかります。

(無題) 削除/引用
No.2025-2 - 2013/05/23 (木) 14:48:59 - 中年
その場合はそのAまでがpolyAであることになります。

3'RACE (SMARTer RACE cDNA amplification kit)について。 削除/引用
No.2025-1 - 2013/05/23 (木) 14:30:34 - iaminert
宜しくお願いします。

clontechのSMARTer RACE cDNA Amplification kitを用いて3'RACEを行います。
kit付属の3' RACE CDS primerの配列が

5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC(T)30VN-3'
N=A,C,G or T, V=A,G or C

となっています。
ここでVにTがないのはなぜでしょうか？
もしサンプルのpolyA直下塩基がAの場合は相補的なプライマーでないということになってしまいませんか？（1塩基異なるだけなのでcDNA合成はされると思いますが）

あさっての方向の質問でしたらすみません。
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