BioTechnicalフォーラム [転写因子の同定方法]

(無題)

No.2021-13 - 2013/05/28 (火) 11:49:25 - まるもり

おお様

お礼が遅くなりました。
何度もアドバイスいただき、ありがとうございます。
受験時の「場合の数」を思い出しました。
本当に多くの「この場合」を考慮しないといけないのですね。。。
頑張ります！

本当にありがとうございました！

(無題)

No.2021-12 - 2013/05/24 (金) 15:02:22 - おお

るしふぇらーぜあっせい単独であれば10倍、少なくとも5倍活性化がないと説得力がないとよくいわれます。ただし2倍程度でも、その転写因子がその配列に結合したり、ゲルシフトで活性化とパラレルな動きが見られたり、じっさいその転写産物が上がるような刺激でるしふぇらーぜの挙動がいっちしたりとか、Chip assayで結合が確認されたりとかするなら説得力がでてきます。

質問者さまのばあいは潰して活性化がしにくくなるわけですから、そう言うすべての場所が転写活性化に何らかの関与をしているというふうに捕らえていいと思います(もちろん実験的なアーティファクと完全に否定できるわけではありませんが)。

同じ転写因子のコンセンサスが複数あって一つつぶすと何割か減り2つつぶすと完全になくなるとかいう場合もあります。

まずはいろいろな場所で減ったりかもしれませんが、メジャーなコントリビューションをしているのはどこか、お考えになっている生物学的な現象でどの転写因子が動いているかのうせいがあるのか、動いていればおもしろいかとか、コンセンサスが複数ある転写因子がコントリビューションが大きい場合があるのでそれがきいている可能性がないかなどで見ていけばいいかと思います。
四、五倍でラインをひいたなら、20倍活性化しているのを基準におくとベースから四、五倍活性化していても最も活性化している状態から4、5分の一でぎりぎりのラインですよね。

(無題)

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No.2021-11 - 2013/05/24 (金) 12:41:58 - まるもり

おお様
つんまる様

見ず知らずの人間のために、丁寧にアドバイスいただき、本当にありがとうございます（どなたからか、書き込みがくるのかと疑問でしたので）
オリゴ＆コンストラクト作製へ進みたいと思います。

最後に、もう少しだけ教えていただきたいのですが。。。
ルシフェラーゼによる転写活性では、空ベクターを１とした時、どれくらい活性が上昇すれば優位とみなされるのでしょうか？
標的としている遺伝子や、転写調節因子にもよるとは思うのですが。

論文を読んでいると、１.５倍になっただけでも優位とされているものもありますが、私の実験系ではコンスタントに６～１０倍活性の上昇が認められます（あやしい場所が数カ所あると申しましたが、その全てを含むコンストラクトでは２０倍にもなります）

現在の系において、例えば点変異を入れたコンストラクトの活性が５倍などと出た時、それを何を基準に、どのように判断すべきなのか、共通の考え方などはあるのでしょうか？

お忙しいとは思いますので、お時間のある時で構いません。
よろしくお願いいたします。

(無題)

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No.2021-10 - 2013/05/24 (金) 01:40:34 - おお

>[Re:9] つんまるさんは書きました :
> モチーフ検索してシスエレメントの候補がしぼれているなら、まずはその配列にポイントミューテーションを入れたコンストラクトを作製してルシフェラーゼアッセイをし、プロモーター活性に重要なシスエレメントを明らかにする。
>
> 目的遺伝子を発現していることが明らかになっている細胞の核抽出液を用いてゲルシフトアッセイを行ない、その配列に結合する因子が存在することを示す。
> また、結合が予想される転写因子に対する抗体を用いてスーパーシフトアッセイを行ない、その配列に結合している転写因子を特定する。
>
> スーパーシフトアッセイで特定した転写因子を過剰発現させてルシフェラーゼアッセイし、機能を確認する。
>

いろいろアプローチの仕方はあるかとおもいますが、やはりルシフェラーゼとゲルシフトのコンビネーションになるかと思いますね。なのでオリごをつくりながらも、そのオリごをるしふぇれーすにいれてあっせいできるようなシステムにしておく方がいいかとおもいます。

いま働いているけいはるしふぇらーぜでゲルシフトはまだやってないので働くかどうかわからないですし、働いていても検証する系がないと確認できないかもしれませんし、ノンスペや関係ないバンドをみていて結局分からなくなるかもしれませんから。

昔やったことがあります。

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No.2021-9 - 2013/05/23 (木) 15:02:56 - つんまる

モチーフ検索してシスエレメントの候補がしぼれているなら、まずはその配列にポイントミューテーションを入れたコンストラクトを作製してルシフェラーゼアッセイをし、プロモーター活性に重要なシスエレメントを明らかにする。

目的遺伝子を発現していることが明らかになっている細胞の核抽出液を用いてゲルシフトアッセイを行ない、その配列に結合する因子が存在することを示す。
また、結合が予想される転写因子に対する抗体を用いてスーパーシフトアッセイを行ない、その配列に結合している転写因子を特定する。

スーパーシフトアッセイで特定した転写因子を過剰発現させてルシフェラーゼアッセイし、機能を確認する。

ちなみにゲルシフトアッセイはDIGラベルでやっていました（学部生にRIを扱わせるのは危険ということで）

10年前のことなので、今はもっと良い方法があるのでしょうかね。

(無題)

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No.2021-8 - 2013/05/23 (木) 14:24:45 - おお

>[Re:7] まるもりさんは書きました :

>
> TESSというサイトで検索したところ、１０こくらいの転写因子があがってきています。
> 貧乏教室なので外注をお願いする勇気がなく、設備がないのでRIも使用不可です。
> 予測をつけて、ビオチンラベルのゲルシフトかと思いましたが、ゲルシフトアッセイを何度も行うとなるとお金かかりますよね。

どうかなぁ。。。ラベルの仕方次第じゃないでしょうか、、、ラベルされたおりごとか頼むと高くつくかもしれませんけど、、、

もしその遺伝子が発現していない(転写活性がない)コントロールがとれるなら、3-4分割ぐらいで転写活性がある核抽出えき特異的なシフトをみてもいいんじゃないかなぁ。

あつとはるしふぇらーぜの系は動いているんだから、徐々にその転写因子の発現ベクターを集めていってもいいかもしれません。

(無題)

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No.2021-7 - 2013/05/23 (木) 11:36:31 - まるもり

おお様
jujo様

アドバイスおよび参考資料、ありがとうございます。
現在のところ、１５０bpまでしぼられています。
もっとしぼってからと思いましたが、ボスに時間の無駄だから先にすすめと言われました。（でも、ストラテジーは自分で考えろということで、方法わからず）
私的には、せめてあと半分以下の長さにしたいと思っています。
しかし、実は活性のある場所が数カ所あるため、うまいしぼり方が思いつかないという問題も抱えています。

TESSというサイトで検索したところ、１０こくらいの転写因子があがってきています。
貧乏教室なので外注をお願いする勇気がなく、設備がないのでRIも使用不可です。
予測をつけて、ビオチンラベルのゲルシフトかと思いましたが、ゲルシフトアッセイを何度も行うとなるとお金かかりますよね。
それならば、MSで解析していただいた方がよいのか。
価格等も再度検討してみます。

ありがとうございました。

ああ、そうか・・・

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No.2021-6 - 2013/05/22 (水) 14:45:22 - Jujo

＞＞おおさん
各抽出液からスタートすればいいんですね、Gel Shiftは実際に手を動かしていないので、細かいところから分からなくて。

＞＞まるもりさん
下記のような試薬は少し参考になるかもしれません。
http://www.promega.co.jp/jp/jp_tech/jp_manuals/GSA.pdf
http://www.piercenet.com/browse.cfm?fldID=7EDAC33E-3981-4E58-8A57-057A8280C68F

MSも行いたくなったら今はバンド切り出しで1本飛ばすのに10万円以下で
受けてくれる会社はありますから、学会発表用や文献の見せデータや
検証が必要なら外注を利用してみてもいいかもしれません。

-------
転写因子が配列から予測できるなら、そのままgel shift assayでもいいんじゃないの。りこんびなんとの蛋白がなくともできますし。その転写因子がアクティブであろう細胞の核抽出液をとってきて、ラベルしたDNAを混ぜればいいわけですし。バンドの特異性はスーパーシフトなどでもしめせますし。

また、蛋白がわからないとしても、転写活性とパラレルなシフトがみつかれば、塩基置換をしたオリゴをを使うことでコンセンサス配列を見るける、あるいは確認することはできます。

またルシフェラーゼアッセイも、配列から転写因子が予測できるなら、過剰発現で活性があがるかなどみれば、ほとんどそこで勝負がついてしまうかもしれません。

(無題)

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No.2021-5 - 2013/05/22 (水) 14:14:33 - おお

>[Re:3] まるもりさんは書きました :
> 早々にご返信いただきありがとうございます！

> 幾つか候補がある中で、片っ端からゲルシフトを行っていくのか？？？と思っていました（しかも、まさにDNAとライセートと抗体を使って）
> MSがないので、WBでの検索になるかと思います。

コンセンサスから配列があるDNAのオリゴを蛋白に混ぜるわけですから、その候補が実際にあなたの細胞でその遺伝子の転写活性を活性化してなくても、くっついてくる可能性があるので、いくつか絞れるかもしれませんけど、決めれるかどうかちょっとわかりませんねぇ。。。

そんな片っ端からというほどいっぱいあるんですか?もしかしてまだ300ベースほどぐらいにしぼったということでしょうか?

転写因子がつきそうなところのポイントミューてーしょんなんかでも絞ることは可能かと思いますが。あるいは、カセットをつかって20bpぐらいをとっかえひっかえしていくとか。

> DNA側からの転写因子の絞り込みって、そんなに行われていないものなのでしょうか。

むかしはMSがそんなに普及してなかったからね。今はけっこうやられているかもしれませんけど。やったけどもわけわからんかったので発表できなかったってうのもまあまああるんじゃないかなぁ。その前に転写因子も出揃った感があるから、やはりコンセンサスからあり得そうなものを当たる方がおおいんじゃないかなぁ。
ものによっては、ChipでDNAひろってきてから、片っ端から配列よんで、ゲノムにアサインするというプロジェクトもあるようなので、データーベースから情報をあたることも多くなってるかもしれませんし。

(無題)

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No.2021-4 - 2013/05/22 (水) 13:55:03 - おお

>[Re:1] まるもりさんは書きました :

> が、そこからどうすればいいのかわかりません。
> 結合するであろう転写因子を配列から予測して、次はどうすればいいのでしょうか？
> 論文では、ルシフェラーゼアッセイの図から、ゲルシフトアッセイの図に続いているものが多いような気がするのですが、その間（行間？）に何をすればいいのかがわかりません。

転写因子が配列から予測できるなら、そのままgel shift assayでもいいんじゃないの。りこんびなんとの蛋白がなくともできますし。その転写因子がアクティブであろう細胞の核抽出液をとってきて、ラベルしたDNAを混ぜればいいわけですし。バンドの特異性はスーパーシフトなどでもしめせますし。

また、蛋白がわからないとしても、転写活性とパラレルなシフトがみつかれば、塩基置換をしたオリゴをを使うことでコンセンサス配列を見るける、あるいは確認することはできます。

またルシフェラーゼアッセイも、配列から転写因子が予測できるなら、過剰発現で活性があがるかなどみれば、ほとんどそこで勝負がついてしまうかもしれません。

(無題)

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No.2021-3 - 2013/05/22 (水) 13:35:49 - まるもり

早々にご返信いただきありがとうございます！
まさにお聞きしたかった（というか、ナゾだった）ところについて、アドバイスいただき、本当に嬉しいです。
幾つか候補がある中で、片っ端からゲルシフトを行っていくのか？？？と思っていました（しかも、まさにDNAとライセートと抗体を使って）
MSがないので、WBでの検索になるかと思います。
DNA側からの転写因子の絞り込みって、そんなに行われていないものなのでしょうか。
論文の奥には、膨大な実験、時間、努力、お金がかくれているのだなぁと改めて思いました。
ありがとうございました！

色々方法はあるように思います

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No.2021-2 - 2013/05/22 (水) 13:04:39 - Jujo

DNA配列から候補転写因子がある程度予測がつくなら、
SDS-PAGE⇒WB、質量分析などで解析する方法はどうでしょうか。

例えば末端をビオチン化したDNA配列をアビジンカラムに固相し、
Cell Lysateを流し、溶出したDNA結合蛋白質群をSDS-PAGEして
候補転写因子の抗体を用いたWBや、バンド切り出し（or ショットガン)で
候補転写因子が結果に含まれるかどうかを検証する。
ただし、カラムのWash条件（塩濃度など）は幾つか検討した方が良いと思います。

Gel Shiftは配列とリコンビナント転写因子蛋白質が揃ってから行うので、
上記のような方法で確信できる候補を絞ってから出ないと、結構大変だと思います。もちろんDNAとLysateと候補蛋白質抗体でGel Shiftを見る方法も取れるかと思います（DNA添加時にバンド位置がシフトする）。
でもLysate由来で綺麗なデータを出すのは苦労すると思います。

もちろん、上記方法はDNA配列がバチッと固まっているという仮定なので
実際に実験をするとなると配列の最適化もはかる必要があると思います。

大昔に転写因子の結合部位を探す方は少し関わりましたが、DNA側からは経験がないので、今はもっとスマートな方法があるのかもしれませんが。

転写因子の同定方法

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No.2021-1 - 2013/05/22 (水) 11:30:38 - まるもり

昨年の４月より卒論の研究を始めました、分子生物学初心者です。
ある遺伝子の発現に関与する転写因子の同定を行いたいです。
転写因子が結合するであろう部位は、欠損体を作って、ルシフェラーゼ活性をみることで、大体しぼれました。
が、そこからどうすればいいのかわかりません。
結合するであろう転写因子を配列から予測して、次はどうすればいいのでしょうか？
論文では、ルシフェラーゼアッセイの図から、ゲルシフトアッセイの図に続いているものが多いような気がするのですが、その間（行間？）に何をすればいいのかがわかりません。
かなり初期的な質問で申し訳ありませんが、どなたか教えてください。
よろしくお願いします。

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