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(無題) 削除/引用 No.1998-13 - 2014/08/06 (水) 11:44:36 - TS NE-PERで得た核画分と上清と、得られたペレットをサンプルバッファーで抽出したものをWBで比較しました。 結果はペレットにはNF-kBはほとんど含まれておらず、NE-PERでのNF-kBの抽出は十分に行われていることが分かりました。

似たような状況に遭遇しました 削除/引用 No.1998-12 - 2014/07/31 (木) 11:12:51 - TS 同じキットを用いて、LPS刺激後の核内NF-kB量の挙動を調べています。 このトピックと同様に、プロトコール通りの方法で得られた核画分の溶液中に十分にNF-kBが抽出されているのか疑問の残る結果が得られました。 そこで、私もdddd様と同様に >Whole cell lysateをそれぞれRIPA、サンプルバッファーで回収 >核分画をNER、RIPA、サンプルバッファーで回収 を検討してみようと考えているのですが、どのような結果になったのか気になっています。 同様の実験をおこなった方とかいらっしゃいますか？

(無題) 削除/引用 No.1998-11 - 2013/06/01 (土) 21:16:06 - dddd 今やっていることを簡単にまとめさせてもらうと、 サイトカインAを加えると、細胞の分化が亢進します。（これは確実。染色・qPCRで評価スミ） その分化には転写因子Xが必須であることが知られています。 免疫細胞蛍光染色で、刺激有り無しで転写因子Xを染めてみると、刺激後には核で転写因子Xが陽性となる細胞の割合が増加。核での転写因子X陽性細胞/DAPIで割合を評価。（これも確実、再現性あり） で、さらに確認実験として、核分画タンパクを用いてWBで転写因子Xの発現を見ようとしているところです。 転写因子Xに関するさらに確実なデータがほしいというのと、合わせて他の転写因子に関する定量的評価もしようと。 核分画タンパクでのWBでは転写因子の挙動がIFと逆なので困っているところです。 ※IFとWBで使っている抗転写因子X抗体は同じものです。 おそらく、WBのほうが何かおかしいのでしょうが、、、 狙いのタンパクが抽出しきれてないのか、内部コントロール(Nuclear matrix protein p84、Lamin B1）も刺激後に合わせて変動してしまってタンパク量の補正の段階でおかしくなっているのか。 次回 Whole cell lysateをそれぞれRIPA、サンプルバッファーで回収 核分画をNER、RIPA、サンプルバッファーで回収 それで、もう一度転写因子XについてWBしてみようかと思ってます。 あと、内部コントロールによる補正あり、なしも比較検討。

(無題) 削除/引用 No.1998-10 - 2013/06/01 (土) 14:15:11 - おお ちょっとややこしくなってきましたね。。。ていうか内容が整理できていない自分がいますが。。。 核をたんりしてから、核を免疫染色するとどうなるでしょうかとおもったり。。。

(無題) 削除/引用 No.1998-9 - 2013/05/31 (金) 12:30:43 - dddd 以前頂いたアドバイスを踏まえて下記の点を変更してタンパクを回収してみました。 ・細胞質分画回収（CERI) (変更前) 　プロトコール通り、細胞を剥離後PBSでwashし、遠心後のペレットに対して細胞質分画回収液（CERI)を加える (変更後) 　60mm dishを氷上でPBSで洗浄後、CERIを加える ・核分画回収（RIPA＆NER) (変更前) 　プロトールのごとく、細胞質分画後のペレットにNERをくわえ、10分ごとのvortexを40分間行う。 (変更後） 　細胞質分画後のペレットにRIPA bufferをくわえ、10分ごとのvortexを40分間行う。途中、２５Gシリンジを通す。 こうした変更を加えることで、 細胞質分画の回収量は約1.5倍―2倍。 核分画タンパクの回収量は約2-4倍になりました。 →チューブに移して洗う操作をなくしたことで、途中の細胞のlossが減ったものと思います。 　また、RIPAをつかうことでNERに比して核蛋白の抽出効率が高まったものと思います。 同じときに回収したNERでの抽出核蛋白とRIPAでの抽出核蛋白をWBで比較してみたところ、Lamin B1はRIPAでの抽出液で数倍―10倍多く含まれていました。（どちらも1.5ug/laneでアプライ） Nuclear matrix protein p84はNERでの抽出液でやや多い(1.2-1.5倍程度) →Nuclear matrixはどちらでもよく抽出できているけど、RIPAを使うことでより多くの種類のタンパクが可溶化できるようになった、ということだと考えてます。 アドバイスのおかげで実験条件はかなり良くなりました。ありがとうございます。 ただ、RIPA bufferを使っても狙いの転写因子は期待通りの挙動を示してくれませんでした。 こうなったら、その「期待」自体が間違っているってことなんでしょうかね。。。。。

(無題) 削除/引用 No.1998-8 - 2013/05/15 (水) 12:08:31 - dddd ぷよぷよ様、おお様 色々とアドバイスありがとうございます。 10cm dishに対して200ulで問題なくできているのでしたら、6cm dishで100ulもいけそうですね。安心しました。 このキットの「細胞をはがしてPBSで洗って、、、」という溶解前の前処理は面倒くさく、変な反応を引き起こしそうで気になってましたので、ぷよぷよ様紹介の変法をやってみようかと思います。リン酸化の状態も保存できるようならさらに嬉しいですし。 そして、おお様の言われるように、より強力にRIPAバッファーで核分画タンパクの抽出をやってみようかと思います。 念のため、NERで抽出した核分画、NER処理後のペレットの溶出液とも比較してみます。 結果が分かりましたら、また報告します。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1998-7 - 2013/05/15 (水) 09:54:13 - ぷよぷよ 残念ながらこのキットを使用してリン酸化タンパクの検討を行っていません。 私は10 cmディッシュに対して200 ulのCERIを直接加え、すぐにスクレイパーで細胞を回収しました。 確かに面積に対してCERIの液量はとても少ないと思います。またこの方法ですと、どうしてもディッシュ上に残存するPBSとCERIが混ざり、CERIが希釈されてしまいます。実際には、200 ulのCERIを加え細胞を回収すると液量が400 ul程度に増えていました。 ただウエスタンブロットをする分には、この方法で行ってもタンパク収量や細胞質分画核分画のコンタミの点で問題ありませんでした。しかしその他の解析を行うときにトラブルの原因になるかもしれません。 上記のことが気になるようであれば、おお様のサジェスチョンのように、スクレイパーで回収→遠心してPBSを丁寧に吸い取る→CERIに溶解、の方が適切かもしれません。

(無題) 削除/引用 No.1998-6 - 2013/05/15 (水) 08:29:26 - dddd おお様 返信ありがとうございます。 いくつかのタイムポイント（刺激後0,24,48,72,96H）で回収するのですが、細胞密度が低い時は60mm dishで100ulのlysis buffer(キットのCERI sulution）を使用することになります。細胞密度が高くなったら200-300ulまで増量します。 200-300ulは良いとして、60mm dishで100ulのlysis bufferはさすがに少ないでしょうか？ いずれにせよ、一度試してみようと思います

(無題) 削除/引用 No.1998-5 - 2013/05/15 (水) 03:58:23 - おお ああ、きっとではトリプシンしょうかになってるんですね、、、ディシュ上でPBSなどであらってスクレイパーではいでそのまま遠心でもいいかとおもいますが、、、 ダイレクトでも、バッファーが極端にめんせきにたいして少なくなければいいかとおもいますが。

(無題) 削除/引用 No.1998-4 - 2013/05/14 (火) 20:16:13 - dddd ＞おお様 ありがとうございます。 免疫蛍光染色のほうはセッティングをそろえて撮影してますので、ご指摘いただいた点は大丈夫と思います。また培養細胞に直接RIPAバッファーを加えたサンプルでウェスタンをした場合は、刺激後の細胞で転写因子の発現が亢進していました。ですので、刺激後にその転写因子の発現が亢進し、更に核移行が亢進する、という現象自体は実際に起こっているものと思います。 NE-PERを使ったキットで再現できてないことに関しましては、ご指摘いただいたNERを使わずにSDS入りのバッファーを用いてlysisすることで対応したいと思います。 ＞ぷよぷよ様 ありがとうございます。 今回の核での転写因子が期待通りに検出できないというトラブルに関しては、その狙いの転写因子が細胞質で変に増えてるわけではないので、核から細胞質に移動したわけではないと思います。 ただ、ご指摘いただいた点は自分も気になってました。剥がしたり洗ったりするのに下手したら１時間以上はかかりますから、何かartificialな反応を起こすには十分すぎる時間だと思います。自分の場合は、もしかしたら転写因子の分解を促しているかもしれませんし。 CERIを直接加えるというアイデア、次回実験時にやってみたいと思います。 CERIを直接加える際にPhosphatase inhibitorも加えることで、リン酸化タンパクもちゃんといい状態で回収できそうですね。ぷよぷよ様はその手法で細胞質のリン酸化タンパクも合わせて評価されたことはありますでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1998-3 - 2013/05/14 (火) 16:10:34 - ぷよぷよ 私も同じキットを使用して同様の実験を行い、結果が安定しないことに困ったことがあります。 私の場合は培養細胞のプレートに直接CERIを添加し細胞を回収することで解決しました。 素人の勝手な予想ですが、キットのプロトコール通り、細胞をトリプシンで剥がして、遠心して、PBSで洗浄して、細胞数をカウントして、また遠心して･･･と作業している間に、せっかく核内に移行した転写因子が核外に戻ってしまうのではないかと思います。このような短時間で転写因子の移行が起きるのかは知りませんが･･･。 ともかく少々荒っぽいですが、刺激後の細胞をPBSで洗浄した後に直接プレートにCERIを加えて細胞を回収してみてはいかがでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1998-2 - 2013/05/13 (月) 21:50:47 - おお キットではないですが、昔興味あった核に存在する蛋白は、よくやられる核抽出のプロトコールでもかなりの量が未抽出だったことがあります。そのキットもたぶんそういう核蛋白抽出の方法に準じていると思われますので、蛋白によっては抽出されずに残っている可能性はあるとおもいます。 一度最後のNER抽出のかわりにSDSを含むようなバッファーで溶解してみるか、NER後のペレットをSDSを含むバッファーでlyseしてみるといいかもしれません。あと、cytosolicのフラクションは期待とおりの結果になっていますか? 気持ち悪いならきっと使わずでも簡単にできる実験ですのでそれでもいいかもしれません。それのほうが各ステップ確認がしやすいですし、あなたのサンプルに適した条件になるようにいじるのがよういですから。 あと免疫染色で核移行されていても(されていると思われる結果でも)、トータルの発現量がおちていれば、インターナルコントロール基準でさがっていることはありえるかもしれません。めんえき染色を刺激有無でside by sideでやって同じ検出感度( 露光時間などをそろえる)でやっていらっしゃるとはおもいますが、、、あるいはWBでのトータル出の比較とか。 >培養細胞をSDSサンプルバッファーやRIPAバッファーなどで抽出した場合はDNAなども抽出されて抽出液が粘っこくなるかと思うのですが、NE-PERキットで抽出した核分画液はさらさらです。 これにかんしては、キットをみますと、抽出後の実験でいろいろなアプリケーションをそうていしているので、変性していない蛋白を得るためにかなりマイルドな条件にしていると思います。弱い界面活性剤か、300mMぐらいのNaClで抽出しているのだろうと思えます(かってな想像ですが)。前述のようにこの条件で残る蛋白はかなりありますが、その様な条件でも部分的に抽出できれば活性測定などには使えますね(gel shiftとか)。

NE-PER kitでの核分画抽出時のトラブル 削除/引用 No.1998-1 - 2013/05/13 (月) 21:15:02 - dddd よろしくお願いします。 Pierce(Thermo scientific)のNE-PER kitでの核分画抽出時のトラブルについての相談です。 このキットにより同様のトラブルがあるのか相談させてください。 とある転写因子の核移行を刺激前後で比較しています。 免疫細胞蛍光染色の結果では、刺激後にその転写因子は核への移行亢進がみられます。 現在、NE-PERキットを用いて、細胞質分画、核分画を分離してウェスタンブロットでその転写因子の発現を比較しています。 問題は、核分画での転写因子の発現が免疫蛍光染色の結果と逆になってしまっていることです。 核分画タンパクは内部コントロール(Nuclear matrix protein p84)で補正し、転写因子の発現を比較していますが、刺激前のほうがその転写因子が核に多く存在する、という結果でした。 一つ心配しているのは、このキットで抽出した場合、転写因子がどの程度効率よく抽出できていのかという点です。 培養細胞をSDSサンプルバッファーやRIPAバッファーなどで抽出した場合はDNAなども抽出されて抽出液が粘っこくなるかと思うのですが、NE-PERキットで抽出した核分画液はさらさらです。 そのため、NE-PERキットで抽出した場合はDNAに結合した転写因子の抽出が悪いのではと心配しています。 転写因子がDNAにしっかり結合すればするほど、抽出液中に出てこなくなるのではという心配です。 NE-PERキットで転写因子の抽出が悪かったというトラブルがありますでしょうか。 NE-PERキットで核分画抽出した後のペレットに転写因子がどの程度残っているかはまだ確認していません。 次回確認する予定ですが、同様のトラブルがおこりうるのか、ここでお聞きできればと思っています。 よろしくお願いします。

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