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大規模解析後のQPCR トピック削除
No.1996-TOPIC - 2013/05/13 (月) 16:48:42 - RPE
ラボでマイクロアレイ等の大規模解析で変化が見られた遺伝子について、QPCRで再確認すると言うことをやっているのですが、調べる遺伝子の数が多いからと一度も検量腺を引かずにΔΔCt値の計算だけで定量比較をやっていて、しかもシングルウェルでの測定なのですが、これで得られてきた結果って信頼性があるものなのでしょうか？
疑問に思ったので議論しましたが、検量腺を引いているヒマはないし、duplicateやtriplicateでやっている金もないと突っぱねられてしまいました。
私は大規模解析から仕事を進めた経験がないのですが、そういうものなのでしょうか？
　
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(無題) 削除/引用
No.1996-4 - 2017/09/15 (金) 19:44:42 - qIHC?
今更ですが、qPCRを理解していれば、「検量線を一度も引かないのは刧僂t法ですらない」と気付くはずです。刧僂t法の根拠文献

で、今回の問題に限って言えば、私なら検量線2本、サンプルmonoplicateで対応します。

なぜ、PCRではduplicateが求められているのか。答えはピペット誤差が指数的増幅反応である以上大きな誤差になりかねないから

じゃあ、同じPlate上にあるduplicateの検量線（8✕2）くらいのサンプルのduplicate誤差が小さければ、ピペッティング手技に問題ないことは証明できますよね

「検量線を一度も引かない」という非科学と、厳密に言うとサンプル一個一個ではピペット誤差あったかもじゃん程度の疑義とで
優先して潰すべきがどちらか分かるはずです

(無題) 削除/引用
No.1996-3 - 2013/05/13 (月) 17:40:08 - RPE
予備実験さん
お返事ありがとうございます。

> リアルタイムPCRにおけるddCtの計算式は、
> PCR反応効率が、ほぼ１００％であるという前提の元、使える計算式です。
>
> 従って、PCR反応効率がいくらなのか、予め予備実験で確認しておく必要があります。
>

に関しては、私もそう思ったのでこれまで主にｑPCRを行ってきた人に聞いたのですが、確かめる必要は無いと突っぱねられました。


> qPCRのスクリーニングの結果を元に、３次解析で詳しく解析を行えば、
> １次スクリーニング（マイクロアレイ）と、今回のqPCRによる２次スクリーニングとまとめて示す事によって、
> 解析手法は少し違っても結果は一貫性があるデータという事が出来ます。
>

二次スクリーニングで絞ったものに関して、きちんとした実験を行ってデータを出せば良いのだとは思いますが、二次スクリーニングの方法が大雑把すぎて気持ちが悪いというのが正直なところです。
お金がないにしても、優先順位をもっと明確にして、絞り込みながらやればもう少し丁寧な解析が出来るのでは？と思うのですが、、、、。

(無題) 削除/引用
No.1996-2 - 2013/05/13 (月) 17:30:58 - 予備実験
リアルタイムPCRにおけるddCtの計算式は、
PCR反応効率が、ほぼ１００％であるという前提の元、使える計算式です。

従って、PCR反応効率がいくらなのか、予め予備実験で確認しておく必要があります。


今回のqPCRでの２次スクリーニングがシングルウェルだけでよいのかどうかは、
その後（３次スクリーニングか詳しい解析）の実験量と質によるでしょう。

qPCRのスクリーニングの結果を元に、３次解析で詳しく解析を行えば、
１次スクリーニング（マイクロアレイ）と、今回のqPCRによる２次スクリーニングとまとめて示す事によって、
解析手法は少し違っても結果は一貫性があるデータという事が出来ます。


もしマイクロアレイの結果とシングルウェルのqPCRの結果だけだと、
ちょっとトップジャーナルは苦しいでしょうねえ。

大規模解析後のQPCR 削除/引用
No.1996-1 - 2013/05/13 (月) 16:48:42 - RPE
ラボでマイクロアレイ等の大規模解析で変化が見られた遺伝子について、QPCRで再確認すると言うことをやっているのですが、調べる遺伝子の数が多いからと一度も検量腺を引かずにΔΔCt値の計算だけで定量比較をやっていて、しかもシングルウェルでの測定なのですが、これで得られてきた結果って信頼性があるものなのでしょうか？
疑問に思ったので議論しましたが、検量腺を引いているヒマはないし、duplicateやtriplicateでやっている金もないと突っぱねられてしまいました。
私は大規模解析から仕事を進めた経験がないのですが、そういうものなのでしょうか？
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